Bioprospecção alvo-direcionada de moduladores da família das proteínas inibidoras de apoptose (IAPS) em extratos de microrganismos marinhos
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Data
2018-09-21
Autores
Barbosa, Gabriel Henrique 
Orientadores
Jimenez, Paula Christine
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Introduction: Electing a good molecular target is still a hindrance regarding the discovery of new drugs. The Inhibitor of Apoptosis Protein family (IAPs) is a relevant target in cancer research, as we find members of this class overexpressed in several tumor types and almost totally absent in normal cells. Objective: Thus, this work aimed to prospect, through a target-guided approach, natural products produced by marine actinobacteria that act as modulators of the IAP family, validating its activity and interaction through in vitro assay. Methods: Three members of the IAP family (i.e. survivin, livin and XIAP) obtained by heterologous expression in E. coli vector were attached to a resin support and incubated with marine actinobacteria extracts using a bioaffinity assay called functional chromatography. Molecules retained in the resin were eluted and analyzed by HPLC-MS, resulting directly in the mass of the ligand. We fractionated the crude extract of the selected actinobacteria (BRA-214) in Sephadex-LH20, silica cartridge, semi-preparative HPLC and manually collected in analytical HPLC, monitored by DAD detector. Isolated compounds were tested for their IC50 in SK-MEL-19 cells and, by Western blotting, inquired about their effects on protein expression of the IAP survivin and other relevant apoptosis markers. Results: 19 crude extracts were submitted to bioaffinity assays; two of them resulted in hits. The selected extract, produced by actinobacteria BRA-214, previously identified as a member of the Streptomyces genus, returned hits of m/z 613, 670, 684, 704, 718 and 752 (M+H+]. Four of them (m/z 613, 704, 718 and 752) were successfully isolated and seem to be unpublished structures. Their fragmentation profile indicates that they belong to the same class of non-ribosomal peptides, except for the 613 m/z hit, which seems to be from another unknown class. The treatment with the compound of m/z 704 promoted a lower expression of survivin in SK-MEL-19 cells. Conclusion: Functional chromatography showed to be a valid and applicable technique to bioprospect ligands to protein from the IAP family, allowing the identification and recovery of unprecedented secondary metabolites that seem to interact and modulate this family of proteins.
Introdução: A elucidação do alvo molecular ainda é um entrave no que tange à descoberta de novos fármacos. A família das Proteínas Inibidoras de Apoptose (IAPs) é um alvo relevante para o câncer, uma vez que membros dessa classe de proteínas encontram-se superexpressos em diversos tipos tumorais e com expressão ausente ou muito baixa em tecidos normais. Objetivo: Este trabalho visou a prospecção alvodirecionada de compostos naturais produzidos por actinobactérias marinhas que apresentem atividade moduladora da família das IAPs, validando sua atividade e interação por meio de ensaios biológicos in vitro. Métodos: Três membros da família, (survivina, livina e XIAP) foram obtidos por expressão heteróloga e incubadas com extratos brutos de actinobactérias marinhas, por meio do ensaio de bioafinidade denominado cromatografia funcional. A análise química de compostos ligantes foi feita por HPLC-MS, resultando na relação m/z do ligante. O extrato bruto da actinobactéria selecionada (BRA-214) foi fracionado em Sephadex LH-20, cartucho de sílica, HPLC semi-preparativo e coletado manualmente em HPLC analítico. O efeito das substâncias isoladas sobre a expressão de survivina e outros marcadores de apoptose foi feita por Western Blotting utilizando como dose os valores de CI50 obtidos dos compostos purificados em linhagem melanoma SK-MEL-19. Resultados: O ensaio de bioafinidade foi feito com 19 extratos, dos quais 2 apresentaram hits. A actinobactéria identificada por BRA-214, pertencente ao gênero Streptomyces, foi selecionada para mais análises, com hits de m/z 613, 670, 684, 704, 718 e 752 [M+H+], dos quais 4 (m/z 613, 704, 718 e 752) foram isolados com sucesso e parecem se tratar de estruturas inéditas. Seus perfis de fragmentação indicam pertencerem a uma mesma classe de peptídeos não ribossomais. Verificou-se que o tratamento com o composto de m/z 704 promoveu diminuição da expressão de survivina. Conclusão: A técnica de cromatografia funcional se mostrou válida e aplicável para a identificação de ligante às IAPs, permitindo a recuperação de substâncias que ainda não haviam sido descritos e que apresentaram interação e modulação à esta família de proteínas.
Introdução: A elucidação do alvo molecular ainda é um entrave no que tange à descoberta de novos fármacos. A família das Proteínas Inibidoras de Apoptose (IAPs) é um alvo relevante para o câncer, uma vez que membros dessa classe de proteínas encontram-se superexpressos em diversos tipos tumorais e com expressão ausente ou muito baixa em tecidos normais. Objetivo: Este trabalho visou a prospecção alvodirecionada de compostos naturais produzidos por actinobactérias marinhas que apresentem atividade moduladora da família das IAPs, validando sua atividade e interação por meio de ensaios biológicos in vitro. Métodos: Três membros da família, (survivina, livina e XIAP) foram obtidos por expressão heteróloga e incubadas com extratos brutos de actinobactérias marinhas, por meio do ensaio de bioafinidade denominado cromatografia funcional. A análise química de compostos ligantes foi feita por HPLC-MS, resultando na relação m/z do ligante. O extrato bruto da actinobactéria selecionada (BRA-214) foi fracionado em Sephadex LH-20, cartucho de sílica, HPLC semi-preparativo e coletado manualmente em HPLC analítico. O efeito das substâncias isoladas sobre a expressão de survivina e outros marcadores de apoptose foi feita por Western Blotting utilizando como dose os valores de CI50 obtidos dos compostos purificados em linhagem melanoma SK-MEL-19. Resultados: O ensaio de bioafinidade foi feito com 19 extratos, dos quais 2 apresentaram hits. A actinobactéria identificada por BRA-214, pertencente ao gênero Streptomyces, foi selecionada para mais análises, com hits de m/z 613, 670, 684, 704, 718 e 752 [M+H+], dos quais 4 (m/z 613, 704, 718 e 752) foram isolados com sucesso e parecem se tratar de estruturas inéditas. Seus perfis de fragmentação indicam pertencerem a uma mesma classe de peptídeos não ribossomais. Verificou-se que o tratamento com o composto de m/z 704 promoveu diminuição da expressão de survivina. Conclusão: A técnica de cromatografia funcional se mostrou válida e aplicável para a identificação de ligante às IAPs, permitindo a recuperação de substâncias que ainda não haviam sido descritos e que apresentaram interação e modulação à esta família de proteínas.
Descrição
Citação
BARBOSA, Gabriel Henrique. Bioprospecção alvo-direcionada de moduladores da família das proteínas inibidoras de apoptose (IAPS) em extratos de microrganismos marinhos. 2018. 99f. Dissertação (Mestrado) - Instituto do Mar, Universidade Federal de São Paulo, Santos, 2018.