Participação Do Ampc Extracelular Na Regulação Da Transmissão Neuromuscular Esquelética
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Data
2017-09-28
Autores
Duarte, Thiago [UNIFESP]
Orientadores
Godinho, Rosely Oliveira [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introduction: In skeletal muscle, the intracellular cyclic AMP regulates processes that include the contraction, metabolism, and expression of synaptic proteins (Duarte et al., 2001; Bergantin et al. 2011). Studies of our group have shown that after the activation of GsPCR or adenylyl cyclase, part of the newly formed intracellular cAMP is transported to the cellular interstitium (Godinho and Costa-Jr 2003; Chiavegatti et al., 2008). The cAMP is able to act as an extracellular signaling molecule through its metabolite adenosine, formed by the sequential action of ecto-phosphodiesterases and ecto-5'-nucleotidases (Chiavegatti et al., 2008). More recently, we have demonstrated that β2 adrenoceptor activation has a biphasic action characterized by the initial potentiation of muscle contraction resulting from the increase of intracellular cAMP, followed by a negative inotropic effect, related to cAMP efflux and activation of A1 receptors by the adenosine metabolite (Duarte et al, 2012). It is known that adenosine formed from ATP released by the motor neuron is able to modulate neuromuscular transmission through its adenosine metabolite and activation of neuronal adenosine receptors (Ribeiro J.A, et al., 1996), but in skeletal muscle, It was not identified whether the efflux and metabolism of cAMP, regulates the neuromuscular transmission Objective: Evaluate the participation of extracellular cAMP and its metabolite adenosine in neuromuscular transmission. Methods: Male diaphragm muscles were used for 3 to 4 months, and muscle contraction was induced by electrical stimulation of the phrenic nerve (n = 3-4). The train-of-four TOF electrical stimulation protocol (2 Hz, 2 ms duration) was used and the ratio between the contraction amplitude of the fourth (T4) and the first stimulus (T1) was determined to evaluate the effect of the neuromuscular blockers d-tubocurarine and hexamethonium in the presence or absence of cAMP, clenbuterol and / or formoterol, with or without preincubation of adenosine receptor antagonists (CGS15943 and ZM241385) or inhibitors of organic anion (probenecid) ecto-5'-nucleotidase (AMPCP). The effect of formoterol on intra- and extracellular cAMP was quantified by time resolving-FRET assay.Results: 300 nM d-tubocurarine and 1.5 mM hexamethonium caused 25% neuromuscular block, this effect was inhibited by the 30 min preincubation with 100 μM cAMP and by the agonists of β2adenoceptors 100 nM clenbuterol and 100 nM formoterol which also promoted a 15% increase in contraction force, these effects were associated with increased of intracellular and extracellular cAMP levels. The adenosine receptor antagonists 100 nM CGS15943 (non-selective) and 100 nM ZM241385 (A2A selective) and the inhibitors of organic anion (300 μM probenecid) and ecto-5'-nucleotidase (100 μM AMPCP) inhibited the effect cAMP and clenbuterol on d-tubocurarine and hexamethonium-induced tetanic fade. Conclusions: The results presented in this work show that the extracellular cAMP adenosine pathway initiated by activation of post-synaptic β2 adrenoceptors modulates the contraction of skeletal muscle induced by phrenic nerve stimulation. These modulations depend on efflux of cAMP and activation of presynaptic adenosine receptors and probably involve increment in ACh release. However, this pathway can act as a paracrine signaling that creates feedback loop and regulation between muscle fibers and motor neurons.
No músculo esquelético, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) intracelular regula processos que incluem a contração, o metabolismo e a expressão de proteínas sinápticas (Duarte et al., 2012; Navegantes et al., 2001; Bergantin et al., 2011). Estudos do nosso grupo mostraram que após a ativação de receptores acoplados à proteína G estimulatória (GsPCR) ou da enzima adenilil ciclase (AC), parte do AMPc intracelular recém-formado é transportado para o interstício celular (Godinho e Costa-Jr, 2003; Chiavegatti et al., 2008). Fora da célula, o AMPc é capaz de atuar como sinalizador extracelular através de seu metabólito adenosina, formado pela ação sequencial de ecto-fosfodiesterases e ecto-5’-nucleotidases (Chiavegatti et al., 2008). Mais recentemente demonstramos que a ativação do adrenoceptor β2 tem uma ação bifásica caracterizada pela potenciação inicial da contração muscular, resultado do aumento do AMPc intracelular, seguida por um efeito inotrópico negativo, relacionado ao efluxo do AMPc e ativação de receptores A1 pelo metabólito adenosina (Duarte et al, 2012). Sabe-se que a adenosina formada a partir do ATP liberado pelo neurônio motor, é capaz de modular a transmissão neuromuscular através do seu metabólito adenosina e ativação dos receptores neuronais de adenosina (Ribeiro J.A, et al; 1996), Porémno músculo esquelético, não foi identificado se o efluxo e metabolização do AMPc, regula a transmissão neuromuscular. O objetivo do trabalho foi avaliar a participação do AMPc extracelular e de seu metabólito adenosina na transmissão neuromuscular. Foram utilizados músculo diafragma de camundongos machos de 3 a 4 meses, e a contração muscular foi induzida pela estimulação elétrica do nervo frênico (n=3-4). Foi utilizado o protocolo de estimulação elétrica train-of-four TOF (2 Hz, 2 ms de duração) e a razão entre a amplitude de contração do quarto (T4) e o primeiro estímulo (T1) foi determinada, para avaliar o efeito dos bloqueadores neuromusculares d-tubocurarina e hexametônio, na presença ou ausência do AMPc e/ou clenbuterol, com ou sem a pré-incubação dos antagonistas dos receptores de adenosina (CGS15943 e ZM241385) ou dos inibidores dos transportadores de ânions orgânicos (probenecida) e da ecto-5`-nucleotidase (AMPCP). O efeito do formoterol no AMPc intracelular e extracelular foi quantificado pelo ensaio de resolução de tempo-FRET.A d-tubocurarina 300 nM e o hexametônio 1,5 mM causaram 25% de bloqueio neuromuscular, esse efeito foi inibido pela pré-incubação por 30 minutos com AMPc 100 μM e pelos agonistas de adrenoceptores β2 clenbuterol 100 nM e formoterol 100 nM que também promoveram um incremento de 15% na força de contração, esses efeitos foram associadosao incremento dos níveis de AMPc intracelular e extracelular. Os antagonistas dos receptores de adenosina CGS15943 100 nM (não seletivo) e ZM241385 100 nM (seletivo A2A) e os inibidores dos transportadores de ânions orgânicos (probenecida 300 μM) e da ecto-5`-nucleotidase (AMPCP 100 μM) inibiram o efeito do AMPc e do clenbuterol no fade induzido pela d-tubocurarina e hexametônio. Os resultados apresentados neste trabalho mostram que a via extracelular AMPc-adenosina iniciada por ativação de adrenoceptores β2 pós-sináptico, modula a contração do músculo esquelético induzida por estimulação do nervo frênico. Essa modulação depende do efluxo do AMPc e ativação de receptores de adenosina pré-sinápticos e provavelmente envolve incremento na liberação de ACh. Contudo, essa via pode funcionar como uma sinalização parácrina que cria um circuito fechado de realimentação e regulação entre as fibras musculares e os neurônios motores.
No músculo esquelético, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) intracelular regula processos que incluem a contração, o metabolismo e a expressão de proteínas sinápticas (Duarte et al., 2012; Navegantes et al., 2001; Bergantin et al., 2011). Estudos do nosso grupo mostraram que após a ativação de receptores acoplados à proteína G estimulatória (GsPCR) ou da enzima adenilil ciclase (AC), parte do AMPc intracelular recém-formado é transportado para o interstício celular (Godinho e Costa-Jr, 2003; Chiavegatti et al., 2008). Fora da célula, o AMPc é capaz de atuar como sinalizador extracelular através de seu metabólito adenosina, formado pela ação sequencial de ecto-fosfodiesterases e ecto-5’-nucleotidases (Chiavegatti et al., 2008). Mais recentemente demonstramos que a ativação do adrenoceptor β2 tem uma ação bifásica caracterizada pela potenciação inicial da contração muscular, resultado do aumento do AMPc intracelular, seguida por um efeito inotrópico negativo, relacionado ao efluxo do AMPc e ativação de receptores A1 pelo metabólito adenosina (Duarte et al, 2012). Sabe-se que a adenosina formada a partir do ATP liberado pelo neurônio motor, é capaz de modular a transmissão neuromuscular através do seu metabólito adenosina e ativação dos receptores neuronais de adenosina (Ribeiro J.A, et al; 1996), Porémno músculo esquelético, não foi identificado se o efluxo e metabolização do AMPc, regula a transmissão neuromuscular. O objetivo do trabalho foi avaliar a participação do AMPc extracelular e de seu metabólito adenosina na transmissão neuromuscular. Foram utilizados músculo diafragma de camundongos machos de 3 a 4 meses, e a contração muscular foi induzida pela estimulação elétrica do nervo frênico (n=3-4). Foi utilizado o protocolo de estimulação elétrica train-of-four TOF (2 Hz, 2 ms de duração) e a razão entre a amplitude de contração do quarto (T4) e o primeiro estímulo (T1) foi determinada, para avaliar o efeito dos bloqueadores neuromusculares d-tubocurarina e hexametônio, na presença ou ausência do AMPc e/ou clenbuterol, com ou sem a pré-incubação dos antagonistas dos receptores de adenosina (CGS15943 e ZM241385) ou dos inibidores dos transportadores de ânions orgânicos (probenecida) e da ecto-5`-nucleotidase (AMPCP). O efeito do formoterol no AMPc intracelular e extracelular foi quantificado pelo ensaio de resolução de tempo-FRET.A d-tubocurarina 300 nM e o hexametônio 1,5 mM causaram 25% de bloqueio neuromuscular, esse efeito foi inibido pela pré-incubação por 30 minutos com AMPc 100 μM e pelos agonistas de adrenoceptores β2 clenbuterol 100 nM e formoterol 100 nM que também promoveram um incremento de 15% na força de contração, esses efeitos foram associadosao incremento dos níveis de AMPc intracelular e extracelular. Os antagonistas dos receptores de adenosina CGS15943 100 nM (não seletivo) e ZM241385 100 nM (seletivo A2A) e os inibidores dos transportadores de ânions orgânicos (probenecida 300 μM) e da ecto-5`-nucleotidase (AMPCP 100 μM) inibiram o efeito do AMPc e do clenbuterol no fade induzido pela d-tubocurarina e hexametônio. Os resultados apresentados neste trabalho mostram que a via extracelular AMPc-adenosina iniciada por ativação de adrenoceptores β2 pós-sináptico, modula a contração do músculo esquelético induzida por estimulação do nervo frênico. Essa modulação depende do efluxo do AMPc e ativação de receptores de adenosina pré-sinápticos e provavelmente envolve incremento na liberação de ACh. Contudo, essa via pode funcionar como uma sinalização parácrina que cria um circuito fechado de realimentação e regulação entre as fibras musculares e os neurônios motores.