Desenvolvimento de uma matriz acelular derivada de bexiga urinária
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Data
2013-02-07
Autores
Sawaki e Nakamura, Ahy Natally [UNIFESP]
Orientadores
Almeida, Fernando Goncalves de Almeida [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Objetivo: Desenvolver um protocolo de decelularização e obter uma matriz acelular de bexiga. Testar a reprodutibilidade dos resultados em duas espécies de animais (ratos e coelhos). Métodos: Bexigas urinárias de ratos Wistar foram lavadas em PBS antes de serem submetidas a um dos três protocolos a seguir: Protocolo R1: no qual foram utilizados PBS, aprotinina, EDTA, solução tampão hipotônica Tris, SDS, DNase e RNase; Protocolo R1*: protocolo semelhante ao anterior (R1) diferindo apenas por não utilizar Rnase; Protocolo R2: em que foram utilizados PBS, aprotinina, água deionizada, SDS e Triton X-100. Como controle foram coletadas bexigas que foram apenas lavadas em PBS. Para verificar a estrutura geral e a presença de componentes celulares, foram feitas lâminas da matriz extracelular resultantes dos três protocolos e dos fragmentos de bexiga (controle). Essas lâminas foram analisadas por meio de H&E, DAPI, imunohistoquímica para α-actina e desmina, e picrosirius. Para verificar a citotoxicidade foram analisados: o crescimento celular em culturas de células-tronco derivadas de músculo (MDSC) utilizando meio de cultivo condicionado com as matrizes resultantes de cada protocolo, e o infiltrado celular em porções de matrizes deixadas em cultura celular de MDSC. Após esses testes, foram realizados implantes alogênicos, no dorso de ratos, das matrizes resultantes dos protocolos R1 e R2, além de implantes de PGA e SIS para comparação. Os implantes foram analisados após 3, 4 e 8 semanas implante. Foram realizadas colorações de H&E e picrosirius. Os três protocolos foram reproduzidos para bexiga urinária de coelhos, com alterações apenas nos tempos de exposição a alguns reagentes. As matrizes resultantes desses protocolos de coelhos C1, C1* e C2 também foram analisadas por meio de H&E, DAPI, picrosirius e imunohistoquímica para α-actina, desmina e vimentina. Foram realizados implantes alogênicos no músculo reto abdominal de coelhos com as matrizes resultantes dos protocolos C1 e C2, PGA e SIS. Os implantes foram analisados com 4 e 8 semanas por meio de H&E e pricrosirius. Resultados: Os três protocolos R1, R1* e R2 para bexiga urinária de ratos foram eficientes na remoção de células. Os “bioscaffolds” resultantes dos três protocolos apresentaram alterações na disposição das fibras colágenas, sendo que o protocolo R2 resultou na matriz com menos alterações em relação à matriz de uma bexiga controle. Nos estudos com cultura de células, o meio condicionado com matriz resultante dos protocolos não alterou o crescimento celular e os “bioscaffolds” deixados em culturas apresentaram poucas células infiltradas com predominância de células na superfície. Quanto aos implantes, após 4 semanas as matrizes resultantes de R1 e R2, o PGA e o SIS ainda eram visíveis macroscopicamente, porém com 8 semanas, apenas o SIS era visível. Os implantes de R1 e R2 desencadearam processos inflamatórios semelhantes com infiltrado linfocítico leve, diferindo do PGA que desencadeou reação de corpo estranho e do SIS que apresentou o infiltrado inflamatório mais intenso dentre todos os implantes. No estudo com bexigas urinárias de coelhos, os três protocolos C1, C1* e C2 também foram eficientes em retirar as células do tecido. Os “bioscaffolds” resultantes desses protocolos apresentaram rede de fibras desorganizadas e menos densas. Os implantes alogênicos em coelhos apresentaram resultados semelhantes aos de ratos: as matrizes resultantes de R1 e R2 apresentaram respostas linfocitárias leves, o PGA desencadeou resposta de corpo estranho, e o SIS foi o que apresentou a resposta inflamatória mais intensa. Conclusões: Os protocolos de decelularização de bexiga urinária de ratos testados apresentam resultados semelhantes porém o protocolo R2 é mais rápido e resulta numa matriz com menos rearranjo das fibras quando comparado à bexiga urinária controle. A resposta imunológica aos implantes desses “bioscaffolds” foi leve. Os protocolos foram reproduzidos para bexiga urinária de coelhos com pequenas modificações nos tempos de exposição aos reagentes de cada protocolo.
Descrição
Citação
SAWAKI E NAKAMURA, Ahy Natally. Desenvolvimento de uma matriz acelular derivada de bexiga urinária. 2013. 70 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2013.