Desenvolvimento de uma matriz acelular derivada de bexiga urinária

Abstract

Objetivo: Desenvolver um protocolo de decelularização e obter uma matriz acelular de bexiga. Testar a reprodutibilidade dos resultados em duas espécies de animais (ratos e coelhos). Métodos: Bexigas urinárias de ratos Wistar foram lavadas em PBS antes de serem submetidas a um dos três protocolos a seguir: Protocolo R1: no qual foram utilizados PBS, aprotinina, EDTA, solução tampão hipotônica Tris, SDS, DNase e RNase; Protocolo R1*: protocolo semelhante ao anterior (R1) diferindo apenas por não utilizar Rnase; Protocolo R2: em que foram utilizados PBS, aprotinina, água deionizada, SDS e Triton X-100. Como controle foram coletadas bexigas que foram apenas lavadas em PBS. Para verificar a estrutura geral e a presença de componentes celulares, foram feitas lâminas da matriz extracelular resultantes dos três protocolos e dos fragmentos de bexiga (controle). Essas lâminas foram analisadas por meio de H&E, DAPI, imunohistoquímica para α-actina e desmina, e picrosirius. Para verificar a citotoxicidade foram analisados: o crescimento celular em culturas de células-tronco derivadas de músculo (MDSC) utilizando meio de cultivo condicionado com as matrizes resultantes de cada protocolo, e o infiltrado celular em porções de matrizes deixadas em cultura celular de MDSC. Após esses testes, foram realizados implantes alogênicos, no dorso de ratos, das matrizes resultantes dos protocolos R1 e R2, além de implantes de PGA e SIS para comparação. Os implantes foram analisados após 3, 4 e 8 semanas implante. Foram realizadas colorações de H&E e picrosirius. Os três protocolos foram reproduzidos para bexiga urinária de coelhos, com alterações apenas nos tempos de exposição a alguns reagentes. As matrizes resultantes desses protocolos de coelhos C1, C1* e C2 também foram analisadas por meio de H&E, DAPI, picrosirius e imunohistoquímica para α-actina, desmina e vimentina. Foram realizados implantes alogênicos no músculo reto abdominal de coelhos com as matrizes resultantes dos protocolos C1 e C2, PGA e SIS. Os implantes foram analisados com 4 e 8 semanas por meio de H&E e pricrosirius. Resultados: Os três protocolos R1, R1* e R2 para bexiga urinária de ratos foram eficientes na remoção de células. Os “bioscaffolds” resultantes dos três protocolos apresentaram alterações na disposição das fibras colágenas, sendo que o protocolo R2 resultou na matriz com menos alterações em relação à matriz de uma bexiga controle. Nos estudos com cultura de células, o meio condicionado com matriz resultante dos protocolos não alterou o crescimento celular e os “bioscaffolds” deixados em culturas apresentaram poucas células infiltradas com predominância de células na superfície. Quanto aos implantes, após 4 semanas as matrizes resultantes de R1 e R2, o PGA e o SIS ainda eram visíveis macroscopicamente, porém com 8 semanas, apenas o SIS era visível. Os implantes de R1 e R2 desencadearam processos inflamatórios semelhantes com infiltrado linfocítico leve, diferindo do PGA que desencadeou reação de corpo estranho e do SIS que apresentou o infiltrado inflamatório mais intenso dentre todos os implantes. No estudo com bexigas urinárias de coelhos, os três protocolos C1, C1* e C2 também foram eficientes em retirar as células do tecido. Os “bioscaffolds” resultantes desses protocolos apresentaram rede de fibras desorganizadas e menos densas. Os implantes alogênicos em coelhos apresentaram resultados semelhantes aos de ratos: as matrizes resultantes de R1 e R2 apresentaram respostas linfocitárias leves, o PGA desencadeou resposta de corpo estranho, e o SIS foi o que apresentou a resposta inflamatória mais intensa. Conclusões: Os protocolos de decelularização de bexiga urinária de ratos testados apresentam resultados semelhantes porém o protocolo R2 é mais rápido e resulta numa matriz com menos rearranjo das fibras quando comparado à bexiga urinária controle. A resposta imunológica aos implantes desses “bioscaffolds” foi leve. Os protocolos foram reproduzidos para bexiga urinária de coelhos com pequenas modificações nos tempos de exposição aos reagentes de cada protocolo.