Avaliação do papel da endostatina imobilizada e regulação do nf-kb em células hk-2 submetidas à injúria por estresse oxidativo
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Data
2015-08-31
Autores
Rocha Filho, Hugo Nobrega da [UNIFESP]
Orientadores
Marumo, Maria Helena Bellini Marumo [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
A Lesão renal aguda (LRA) é uma síndrome resultante da queda abrupta na taxa de filtração glomerular, acarretando profunda depleção de ATP intracelular. Tais alterações promovem a geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs), ativando mecanismos de estresse oxidativo e morte celular. As EROs participam da ativação do fator de transcrição nuclear NF-kB. A região NC1 do colágeno XVIII pode sofrer clivagem por proteases ou metaloproteinases e liberar endostatina (ES) e suas isoformas. Em alguns trabalhos anteriores nosso grupo demonstrou, in vitro, que uma das isoformas da ES imobilizada promoveu a sobrevivência de células endoteliais por meio do favorecimento da adesão celular. A partir de tais evidências, nosso objetivo foi avaliar o papel da ES imobilizada e a regulação do NF-kB em células HK-2 submetidas a injúria por estresse oxidativo. Desse forma, células HK-2 com (HK-2/ES) e sem ES (HK-2), foram injuriadas pela exposição ao Peróxido de Hidrogênio (H2O2) na concentração de 1mM por 2 horas e após 24 e 48 horas foram analisadas. Células HK-2 que não foram injuriadas foram nomeadas como grupo Controle. Avaliou-se o papel da ES imobilizada e a regulação do NF-kB através dos seguintes ensaios: Avaliação da viabilidade celular (ensaios de MTS e quantificação da enzima Lactato Desidrogenase - LDH), quantificação de EROs (citometria de fluxo com a sonda CM-H2DCFDA) e a expressão gênica do NF-kB através de PCR em tempo real e sua ligação ao DNA pelo ensaio do desvio da mobilidade eletroforética (EMSA). Nossos resultados evidenciaram que as células do grupo HK-2/ES apresentaram taxas de atividade mitocondrial/viabilidade celular de 49% (P < 0,001) após 24horas e de 25% (P < 0,001) após 48horas maiores em relação as HK-2. A quantificação de LDH revelou que após 24hs de injúria as células HK-2/ES apresentaram uma taxa de liberação de LDH 26% menor em relação as células foram injuriadas sem o prévio revestimento com ES. O resultados da quantificação de EROs corroboraram os achados dos ensaios anteriores. As células HK-2/ES apresentaram redução na produção de EROS de 35% em 24hs (HK-2 vs HK-2/ES P<0,005) e de 27% em 48hs (HK-2 vs HK-2/ES P<0,003). As células HK-2/ES apresentaram uma diminuição da transcrição das subunidades p-50 de 3,5 vezes (P < 0,001) e p65 de 3,4 vezes (P < 0,001) da via de sinalização do NF-?B. Os resultados do EMSA mostraram que o revestimento com ES acarretou uma diminuição da ativação do NF-KB. Assim nossos resultados indicam que a ES imobilizada minimiza a ativação do NFK-B após injúria por estresse oxidativo em células tubulares, refletindo no aumento da viabilidade celular.
Descrição
Citação
ROCHA FILHO, Hugo Nobrega da. Avaliação do papel da endostatina imobilizada e regulação do nf-kb em células hk-2 submetidas à injúria por estresse oxidativo. 2015. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.