Perfil de expressão das formas de splicing alternativo da isoforma induzível da enzima óxido nítrico sintase em tumores humanos de mama
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Data
2015-09-30
Autores
Castro, Eloisa Dognani [UNIFESP]
Orientadores
Monteiro, Hugo Pequeno Monteiro [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Nitric oxide (NO) is a free radical that acts on the regulation of many physiological and pathophysiological processes. Three isoforms of the enzyme NO synthase (NOS) respond for intracellular NO production in normal and tumor mammalian cells. Two isoforms are constitutive, the neuronal and endothelial NOS, and one is inducible (iNOS), initially isolated in macrophages. NO mediated effects on tumor cells depend on NOS expression levels, intracellular and extracellular concentrations of NO in tumor microenvironment and cell genetic content. Tumor cells express variable levels of NOS isoforms, among them iNOS has been reported to be expressed in different tumor cell lines. The gene that codifies to iNOS presents 27 exons and alternative splicing variants have been described in several human tissues, in alveolar macrophages and in tumor cells. Breast cancer is a multifactorial and heterogeneous disease basically classified according to the expression of estrogen, progesterone receptors (ER and PR, respectively), and HER-2 expression. It has been shown that high iNOS expression is associated with a poor prognostic in patients bearing ER-negative tumors. Purpose: To investigate the iNOS expression and of two alternative splicing variants (8- 9- and 9-10-11-) of the enzyme in breast cancer celllines and clinical samples. To correlate their expressions levels to tumor subtypes and to NO production levels. Methods: Two cell lines were used: one ER-positive (MCF7) and other ER-negative (MDA-MB-231). Cell isolation from clinical samples was made by enzymatic digestion followed by differential centrifugation to obtain epithelial cells and fibroblasts. Intracellular NO levels were measured by flow cytometry, and the quantification of iNOS and alternative splicing variants expressions were made by Southern blotting and qPCR. Results: Endogenous NO levels were higher in ER-negative cells (MDA-MB-231 cells and epithelial cells and fibroblasts from tumor cells obtained from patients) if compared with ER-positive cells (MCF-7 cells and epithelial cells and fibroblasts from tumor cells obtained from patients). The NO production by the fibroblasts was related to inflammatory infiltrate levels on tumor site. There was no correlation between iNOS expression levels and NO production. Southern blotting analysis of iNOS alternative splicing variants showed no correlation between their expression levels and tumor subtypes phenotypes. However, a high expression of 9- 10- 11- variant was found in the micropapillary tumor. Conclusion: Celllines and primary cells showed that there is no correlation between the iNOS expression profile, the alternative splicing variants and the NO production levels. These observations reinforce the existence of a complex mechanism of regulation of iNOS expression on breast cancer. Furthermore, high expression levels of 9- 10- 11- variant on micropapillary tumor shows the hecessity of more investigations in the regulation of iNOS expression in this kind of tumor. Finally, our findings further demonstrate the complex regulation of iNOS expression levels and NO production in breast cancer. Considering the importance of NO on tumor cell biology, further investigations of these mechanisms are relevant.
o óxido nítrico (NO) é um radical livre relativamente estável que atua na regulação de diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos. A produção de NO nas células se dá pelas isoformas das óxido nítrico sintases (NOS), sendo duas constitutivas - a neuronal (nNOS) e a endotelial (eNOS) - e uma induzível (iNOS). No câncer, os efeitos do NO dependem dos níveis de expressão das NOS, das concentrações intracelulares e extracelulares de NO no ambiente tumoral, do conteúdo genético das células, da sensibilidade celular e do tipo celular envolvido. A iNOS é codificada por um gene que apresenta 27 éxons e, além da forma completa desta enzima, já foram identificadas variantes de splicing alternativo em células de diversos tecidos humanos, em macrófagos alveolares e em linhagens celulares tumorais. Em relação ao câncer de mama, se trata de uma doença multifatorial e bastante heterogênea, classificada basicamente de acordo com a expressão dos receptores de estrógeno (ER) e de progesterona (PR) e do HER-2. Já se mostrou que alta expressão de iNOS está relacionada a uma menor taxa de sobrevivência em pacientes com tumores ER-negativos. Objetivos: Investigar a expressão da iNOS e de duas variantes de splicing alternativo (8- 9- e 9- 10- 1r) em linhagens celulares e em amostras clínicas de tumores de mama; correlacionar a expressão dessas com os subtipos tumorais e com a produção de NO. Métodos: Foram utilizadas duas linhagens celulares de tumores de mama: uma ERpositiva (MCF7) e uma ER-negativa (MDA-MB-231). Foi realizado o isolamento de células das amostras clínicas por meio de digestão enzimática seguida por centrifugação diferencial, obtendo-se células epiteliais e fibroblastos. Para todos os tipos celulares foi realizada a mensuração da produção intracelular de NO por citometria de fluxo e a quantificação da expressão da iNOS e suas variantes de splicing alternativo pela técnica de Southern blotting e por qPCR. Resultados: Tanto para as linhagens quanto para as células epiteliais e fibroblastos, foi verificado que as células ER-negativas apresentam maior produção de NO comparado às ER-positivas. A produção de NO nos fibroblastos está relacionada à intensidade do infiltrado inflamatório no sítio tumoral. Não houve correlação entre os níveis de expressão da iNOS e a produção de NO. As variantes de splicing alternativo puderam ser analisadas apenas pela técnica de Southern blotting, porém < não foi verificada correlação entre a expressão delas e os subtipos tumorais. No entanto, a variante 3 (9- 10- 11-) se mostrou bastante evidente no tumor micropapilar. Conclusão: Tanto para as linhagens celulares quanto para as células primárias, ficou demonstrado que não há relação entre o perfil de expressão da iNOS, suas formas de splicing alternativo e os níveis de produção de NO. Essas observações reforçam a existência de um mecanismo de regulação bastante complexo da expressão da enzima. A forte expressão da variante 3 no tumorrnicropapilar mostra a necessidade da investigação da regulação da expressão da iNOS nesse tipo tumoral. Assim, o trabalho reforça a complexa regulação da iNOS e da consequente produção de NO por esta enzima nos tumores de mama. Dada a importância do NO na biologia dos tumores, uma maior investigação
o óxido nítrico (NO) é um radical livre relativamente estável que atua na regulação de diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos. A produção de NO nas células se dá pelas isoformas das óxido nítrico sintases (NOS), sendo duas constitutivas - a neuronal (nNOS) e a endotelial (eNOS) - e uma induzível (iNOS). No câncer, os efeitos do NO dependem dos níveis de expressão das NOS, das concentrações intracelulares e extracelulares de NO no ambiente tumoral, do conteúdo genético das células, da sensibilidade celular e do tipo celular envolvido. A iNOS é codificada por um gene que apresenta 27 éxons e, além da forma completa desta enzima, já foram identificadas variantes de splicing alternativo em células de diversos tecidos humanos, em macrófagos alveolares e em linhagens celulares tumorais. Em relação ao câncer de mama, se trata de uma doença multifatorial e bastante heterogênea, classificada basicamente de acordo com a expressão dos receptores de estrógeno (ER) e de progesterona (PR) e do HER-2. Já se mostrou que alta expressão de iNOS está relacionada a uma menor taxa de sobrevivência em pacientes com tumores ER-negativos. Objetivos: Investigar a expressão da iNOS e de duas variantes de splicing alternativo (8- 9- e 9- 10- 1r) em linhagens celulares e em amostras clínicas de tumores de mama; correlacionar a expressão dessas com os subtipos tumorais e com a produção de NO. Métodos: Foram utilizadas duas linhagens celulares de tumores de mama: uma ERpositiva (MCF7) e uma ER-negativa (MDA-MB-231). Foi realizado o isolamento de células das amostras clínicas por meio de digestão enzimática seguida por centrifugação diferencial, obtendo-se células epiteliais e fibroblastos. Para todos os tipos celulares foi realizada a mensuração da produção intracelular de NO por citometria de fluxo e a quantificação da expressão da iNOS e suas variantes de splicing alternativo pela técnica de Southern blotting e por qPCR. Resultados: Tanto para as linhagens quanto para as células epiteliais e fibroblastos, foi verificado que as células ER-negativas apresentam maior produção de NO comparado às ER-positivas. A produção de NO nos fibroblastos está relacionada à intensidade do infiltrado inflamatório no sítio tumoral. Não houve correlação entre os níveis de expressão da iNOS e a produção de NO. As variantes de splicing alternativo puderam ser analisadas apenas pela técnica de Southern blotting, porém < não foi verificada correlação entre a expressão delas e os subtipos tumorais. No entanto, a variante 3 (9- 10- 11-) se mostrou bastante evidente no tumor micropapilar. Conclusão: Tanto para as linhagens celulares quanto para as células primárias, ficou demonstrado que não há relação entre o perfil de expressão da iNOS, suas formas de splicing alternativo e os níveis de produção de NO. Essas observações reforçam a existência de um mecanismo de regulação bastante complexo da expressão da enzima. A forte expressão da variante 3 no tumorrnicropapilar mostra a necessidade da investigação da regulação da expressão da iNOS nesse tipo tumoral. Assim, o trabalho reforça a complexa regulação da iNOS e da consequente produção de NO por esta enzima nos tumores de mama. Dada a importância do NO na biologia dos tumores, uma maior investigação
Descrição
Citação
CASTRO, Eloisa Dognani. Perfil de expressão das formas de splicing alternativo da isoforma induzível da enzima óxido nítrico sintase em tumores humanos de mama. 2015. 77 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.