Caracterização estrutural e funcional da glicoproteína ssp-4 de formas amastigotas de trypanosoma cruzi
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Data
2016-10-31
Autores
Florentino, Pilar [UNIFESP]
Orientadores
Mortara, Renato Arruda [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas? disease of great importance in Latin America. Currently this protozoan is classified into six different groups, Tc I-VI, based on molecular markers. In its life cycle, T. cruzi alternates between evolutionary stages with biochemical and morphological differences: epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes; metacyclic and blood trypomastigotes are the classically infective forms. However, it is known that amastigotes derived from trypomastigotes in the extracellular milieu are also capable of infecting cells in vitro and in vivo. These extracellular amastigotes (EAs) have a specific surface antigen called Ssp-4 a 70-100 kDa glycoprotein anchored to the membrane by glycosylphosphatidylinositol (GPI) and recognized by monoclonal antibodies (mAb) 2C2 and 1D9. Ssp-4 is released into the extracellular environment by EAs. In this study, it was revealed that EAs shed vesicles when adhered to modified surfaces and non-professional phagocytic cells and material secreted by these parasites could modulate their infectivity. To characterize the functional aspects of Ssp-4, first the amino acid sequence was determined. Then, it was observed that Ssp-4 protein and mRNA transcripts expression are increased in EAs of less infective strain (strain CL). Moreover, the distribution of Ssp-4 carbohydrate epitopes is polymorphic among different T. cruzi strains/isolates. Thus, a correlation between EA infectivity and carbohydrate epitopes (defined by mAb1D9 and 2C2) expression was proposed: more infective parasites (G strain) exhibit high reactivity with mAb1D9 and low reactivity with mAb2C2; conversely, less infective parasites (CL strain) have higher reactivity with mAb2C2 and lower with mAb1D9. Finally, we investigated whether EA interaction could occur via carbohydrate epitope associated with Ssp-4 defined by mAb1D9. Thus, it was observed that the invading EA recruit galectin-3 (Gal-3), a lectin that specifically binds to ?-galactosides, to the invasion cup in HeLa cells. It was also shown that Gal-3 interacts with the surface antigen defined by mAb1D9. Altogether, the results from this thesis showed that Ssp-4 is secreted associated or not to vesicles, and despite being less expressed in more infective parasites, polymorphic expression of carbohydrate epitopes may reflect in increased EA infectivity to HeLa cells.
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, de grande relevância na América Latina. Atualmente, este protozoário está subdividido em seis linhagens distintas, Tc I a Tc VI, com base em estudos moleculares. Em seu ciclo de vida heteroxeno, T. cruzi alterna entre estágios evolutivos que apresentam diferenças bioquímicas e morfológicas: as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas; os tripomastigotas metacíclicos e sanguíneos são as formas infectivas clássicas. No entanto, sabe-se que amastigotas derivados de tripomastigotas, independente do estágio intracelular no mamífero, são também capazes de infectar células in vitro. Estes amastigotas extracelulares (AEs) apresentam um antígeno de superfície específico de amastigotas (Ssp-4), glicoproteína entre 70-100 kDa ancorada à membrana por glicosilfosfatidilinositol (GPI) e reconhecida pelos anticorpos monoclonais (mAb) 2C2 e 1D9. Sabe-se, também, que Ssp-4 é liberada progressivamente para o ambiente extracelular. No presente estudo, foi evidenciado que AEs secretam vesículas, quando aderidos à superfície de células fagocíticas não profissionais, e que o material secretado por estes parasitas, associado ou não a vesículas, pode modular a sua infectividade. Para caracterizar aspectos funcionais de Ssp-4, primeiramente a sequência de aminoácidos da glicoproteína foi identificada. Em seguida, observou-se que a expressão de transcritos RNAm e proteica de Ssp-4 é maior em AE de cepa menos infectiva. No entanto, a distribuição de carboidratos de Ssp-4 apresenta-se polimórfica entre diferentes cepas/isolados de T. cruzi. Assim, evidenciou-se uma correlação entre infectividade de AE e a expressão dos epítopos de carboidrato definidos por mAb1D9 e 2C2: parasitas mais infectivos (cepa G) apresentam alta reatividade com mAb1D9 e baixa reatividade com mAb2C2; inversamente, parasitas menos infectivos (cepa CL) têm maior reatividade com mAb2C2 e menor com mAb1D9. Por último, foi investigado se a interação de AE poderia ocorrer via antígeno de carboidrato associado a Ssp-4, definido por mAb1D9. Dessa forma, observou-se que a internalização de AE recruta para a taça de invasão galectina-3 (Gal-3), lectina que se liga especificamente a ?-galactosídeos. Foi demonstrado que Gal-3 interage com o antígeno de superfície definido por mAb1D9. Para tanto, os resultados desta tese revelam que Ssp-4 é secretada associada ou não a vesículas e que, apesar de ser menos expressa em parasitas mais infectivos,apresenta distribuição polimórfica dos epítopos de carboidrato que se reflete na infectividade de AE por células fagocíticas não profissionais.
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, de grande relevância na América Latina. Atualmente, este protozoário está subdividido em seis linhagens distintas, Tc I a Tc VI, com base em estudos moleculares. Em seu ciclo de vida heteroxeno, T. cruzi alterna entre estágios evolutivos que apresentam diferenças bioquímicas e morfológicas: as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas; os tripomastigotas metacíclicos e sanguíneos são as formas infectivas clássicas. No entanto, sabe-se que amastigotas derivados de tripomastigotas, independente do estágio intracelular no mamífero, são também capazes de infectar células in vitro. Estes amastigotas extracelulares (AEs) apresentam um antígeno de superfície específico de amastigotas (Ssp-4), glicoproteína entre 70-100 kDa ancorada à membrana por glicosilfosfatidilinositol (GPI) e reconhecida pelos anticorpos monoclonais (mAb) 2C2 e 1D9. Sabe-se, também, que Ssp-4 é liberada progressivamente para o ambiente extracelular. No presente estudo, foi evidenciado que AEs secretam vesículas, quando aderidos à superfície de células fagocíticas não profissionais, e que o material secretado por estes parasitas, associado ou não a vesículas, pode modular a sua infectividade. Para caracterizar aspectos funcionais de Ssp-4, primeiramente a sequência de aminoácidos da glicoproteína foi identificada. Em seguida, observou-se que a expressão de transcritos RNAm e proteica de Ssp-4 é maior em AE de cepa menos infectiva. No entanto, a distribuição de carboidratos de Ssp-4 apresenta-se polimórfica entre diferentes cepas/isolados de T. cruzi. Assim, evidenciou-se uma correlação entre infectividade de AE e a expressão dos epítopos de carboidrato definidos por mAb1D9 e 2C2: parasitas mais infectivos (cepa G) apresentam alta reatividade com mAb1D9 e baixa reatividade com mAb2C2; inversamente, parasitas menos infectivos (cepa CL) têm maior reatividade com mAb2C2 e menor com mAb1D9. Por último, foi investigado se a interação de AE poderia ocorrer via antígeno de carboidrato associado a Ssp-4, definido por mAb1D9. Dessa forma, observou-se que a internalização de AE recruta para a taça de invasão galectina-3 (Gal-3), lectina que se liga especificamente a ?-galactosídeos. Foi demonstrado que Gal-3 interage com o antígeno de superfície definido por mAb1D9. Para tanto, os resultados desta tese revelam que Ssp-4 é secretada associada ou não a vesículas e que, apesar de ser menos expressa em parasitas mais infectivos,apresenta distribuição polimórfica dos epítopos de carboidrato que se reflete na infectividade de AE por células fagocíticas não profissionais.
Descrição
Citação
FLORENTINO, Pilar. Caracterização estrutural e funcional da glicoproteína ssp-4 de formas amastigotas de trypanosoma cruzi. 2016. 100 f. Tese (Doutorado em Microbiologia e Imunologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.