Caracterização dos mecanismos de resistência à polimixina b em isolados clínicos de aBaumannii após a exposição in vitro à mesma e sua implicação na adesão e produção de biofilme
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Date
2016-01-08
Authors
Carneiro, Talita Barone [UNIFESP]
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Gales, Ana Cristina Gales [UNIFESP]
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Dissertação de mestrado
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Abstract
Acinetobacter baumannii is one of the most common pathogens causing serious infections in hospitalized patients. These microorganisms have high ability to adapt to the hospital environmental, and acquire resistance to almost all available antimicrobials. The polymyxins are the last therapeutic options for treatment of these infections. We evaluated the mechanism of resistance and biofilm production among A. baumannii clinical isolates after in vitro exposition to polymyxin B, after 10 consecutive days, using increased concentrations of polymyxin B sulfate. pmrCAB and lpxACD genes, related with polymyxins resistance and ompA, csuE and pgaC genes, involved with the biofilm production were analyzed by nucleotide sequencing and qRT-PCR. Potential Zeta of bacterials membrane and biofilm quantification in microtiter plates were also evaluated. The exposition of A. baumannii clinical isolates to polymyxin B resulted in polymyxin B resistance in all tested isolates, and led to the reduction of MICs to other tested antimicrobials, except for minociclin. Five isolates had mutations in the pmrB and 3 isolates in the lpxC genes, after polymyxin B exposition. One isolate had pmrB and lpxC mutations concomitantly. The relative transcription rates were reduced for pmrB, while they were increased for lpxC after most isolates after polymyxin B exposition. In contrast, no significant differences in the membrane zeta potencial and biofilm quantification were noticed. All isolates had the ompA and most isolates (12) had csuE transcriptional levels increased. In addition, 11 isolates had elevation in the pgaC transcription rates after polymyxin B exposition. Our study illustrates the complexity of mechanisms leading to polymyxin resistance because in most isolates the mechanism remained undetermined. Although changes in the outer membrane permeability might have occurred after polymyxin B exposure, they were not significant enough to reduce the negative electric charge of the outer membrane or biofilm production by A. baumannii resistant to polymyxin B.
Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos isolados de infecções graves em todo o mundo. Esses microrganismos possuem grande capacidade de se adaptar e sobreviver em condições adversas o que contribui para sua persistência e consequente aquisição de mecanismos de resistência, limitando as opções terapêuticas disponíveis. As polimixinas constituem uma das últimas opções terapêuticas para o tratamento de infecções graves por A. baumannii multirresistentes. Neste estudo avaliamos os mecanismos de resistência à polimixina B e a produção de biofilme em isolados clínicos de A. baumannii após a exposição in vitro à polimixina B, em concentrações crescentes, por 10 dias consecutivos. Os genes que compõe o sistema regulatório pmrCAB e a via de biossíntese do LPS, lpxACD, além dos genes envolvidos com a produção de biofilme ompA, csuE e pgaC foram avaliados por sequenciamento e qRT-PCR. As cargas de superfície dos isolados foram avaliadas por quantificação do potencial zeta de membrana. A produção de biofilme foi avaliada fenotipicamente pela quantificação em microplaca de poliestireno. Depois de expostos à polimixina B, todos os isolados clínicos de A. baumannii tornaram-se resistentes à essa droga e redução das CIMs para todos os outros antimicrobianos testados, com exceção da minociclina. Cinco isolados apresentaram mutação no gene pmrB e 3 isolados no lpxC. Um isolado apresentou mutação concomitante nos dois genes pmrB e lpxC. A maioria dos isolados apresentou redução da transcrição de pmrB e aumento da transcrição de lpxC. Apesar disso, não foi observada alteração significativa no potencial zeta de membrana. Também não foi observada alteração significativa na quantificação da produção de biofilme em microplaca de poliestireno. Entretanto, todos os isolados apresentaram aumento da transcrição de ompA e a maioria deles (12 isolados) teve a transcrição de csuE aumentada após a exposição à polimixina B. Ambos os genes estão envolvidos com adesão da bactéria em superfícies bióticas e abióticas. Onze dos 16 isolados apresentaram aumento também de pgaC, gene responsável pela produção da matriz do biofilme em Acinetobacter spp. Este estudo confirma a complexidade dos mecanismos de resistência à polimixina B, já que o mesmo não pode ser determinado na maioria dos isolados. Embora mudanças possam ter ocorrido na membrana celular externa dos isolados de A. baumannii resistentes à polimixina B, estas não foram suficientes para alterar significativamente a carga negativa da membrana celular externa potencial de membrana, nem a capacidade de produzir biofilme destas amostras.
Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos isolados de infecções graves em todo o mundo. Esses microrganismos possuem grande capacidade de se adaptar e sobreviver em condições adversas o que contribui para sua persistência e consequente aquisição de mecanismos de resistência, limitando as opções terapêuticas disponíveis. As polimixinas constituem uma das últimas opções terapêuticas para o tratamento de infecções graves por A. baumannii multirresistentes. Neste estudo avaliamos os mecanismos de resistência à polimixina B e a produção de biofilme em isolados clínicos de A. baumannii após a exposição in vitro à polimixina B, em concentrações crescentes, por 10 dias consecutivos. Os genes que compõe o sistema regulatório pmrCAB e a via de biossíntese do LPS, lpxACD, além dos genes envolvidos com a produção de biofilme ompA, csuE e pgaC foram avaliados por sequenciamento e qRT-PCR. As cargas de superfície dos isolados foram avaliadas por quantificação do potencial zeta de membrana. A produção de biofilme foi avaliada fenotipicamente pela quantificação em microplaca de poliestireno. Depois de expostos à polimixina B, todos os isolados clínicos de A. baumannii tornaram-se resistentes à essa droga e redução das CIMs para todos os outros antimicrobianos testados, com exceção da minociclina. Cinco isolados apresentaram mutação no gene pmrB e 3 isolados no lpxC. Um isolado apresentou mutação concomitante nos dois genes pmrB e lpxC. A maioria dos isolados apresentou redução da transcrição de pmrB e aumento da transcrição de lpxC. Apesar disso, não foi observada alteração significativa no potencial zeta de membrana. Também não foi observada alteração significativa na quantificação da produção de biofilme em microplaca de poliestireno. Entretanto, todos os isolados apresentaram aumento da transcrição de ompA e a maioria deles (12 isolados) teve a transcrição de csuE aumentada após a exposição à polimixina B. Ambos os genes estão envolvidos com adesão da bactéria em superfícies bióticas e abióticas. Onze dos 16 isolados apresentaram aumento também de pgaC, gene responsável pela produção da matriz do biofilme em Acinetobacter spp. Este estudo confirma a complexidade dos mecanismos de resistência à polimixina B, já que o mesmo não pode ser determinado na maioria dos isolados. Embora mudanças possam ter ocorrido na membrana celular externa dos isolados de A. baumannii resistentes à polimixina B, estas não foram suficientes para alterar significativamente a carga negativa da membrana celular externa potencial de membrana, nem a capacidade de produzir biofilme destas amostras.
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CARNEIRO, Talita Barone. Caracterização dos mecanismos de resistência à polimixina b em isolados clínicos de aBaumannii após a exposição in vitro à mesma e sua implicação na adesão e produção de biofilme. 2016. 120 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.