Uso de antagonista farmacológico no estudo do papel do receptor p2x7 nas alterações causadas por crises induzidas por pilocarpina
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Data
2015-02-28
Autores
Araujo, Michelle Gasparetti Leao [UNIFESP]
Orientadores
Fernandes, Maria Jose da Silva Fernandes [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common type of focal epilepsy, most cases displaying seizures refractory to antiepileptic drugs, with hippocampal sclerosis (HS) the most common structural abnormality. The pilocarpine-induced epilepsy model reproduces the main features of TLE. Pilocarpine is a cholinergic agonist and when administered systemically in high doses, induces status epilepticus (SE), HS, synaptic reorganization and spontaneous recurrent seizures. SE induces changes in neurotransmitter systems, including the purinergic systems. Studies showed an increase in subtypes of the purinergic receptors P2X in the TLE model induced with pilocarpine, and the increase of P2X7 receptor (P2X7R) being considered as the mechanism in which promotes the excitotoxity and hyper-excitability. The increase in the purinergic signaling is, therefore, one of the alterations caused by seizures and needing elucidation. The use of antagonists has assisted in the study of this signaling in epilepsy. Aims: Elucidate the role of P2X7R, through the administration of the antagonist AZ-10606120 (AZ), in the cellular death process in the hippocampus and in the epileptogenesis in animals underwent the pilocarpine-induced model of TLE, and in calcium mobility in hipocampal slices. Methods: The AZ was administered intracerebroventricularly (icv) at doses of 1?g, 2?g and 3?g, 30 minutes following SE, in animals underwent to pilocarpine-induced mode and in control animals, and the hippocampal cellular death process analyzed by Fluoro Jade B (FJ-B) labelling. The dose that caused the lowest number of FJ-B positive cells was chosen for the study (3?g). Therefore, four groups were studied: Saline+Vehicle, Saline+AZ, Pilo+Vehicle, Pilo+AZ. The quantification of P2X7R was analyzed by Western Blot. For the intracellular calcium study, was used hippocampal slices of control animals, in which was incubated with Fluo-4AM calcium dye. Then, slices was incubated with AZ at concentrations of 2.5?M, 5?M and 10?M or saline, and stimulated with BzATP. The concentrations of AZ which have caused the lowest hate of intracellular calcium (2.5?M) was used in the groups studied: Salina+BzATP, Salina+AZ+BzATP, Pilo+BzATP e Pilo+AZ+BzATP. Behavioral assessment was performed over 30 days after SE in animals underwent the pilocarpine model or received saline, with or without AZ administration. Results: The dose of 3?g of AZ i.c.v. caused a reduction of the number of FJ-B labeled cell in the CA1, CA3 and the hilus of dentate gyrus in animals underwent the SE induced with pilocarpine. This dose also reduced the expression of P2X7R (-42%) in animals of Pilo+AZ group compared to Pilo+Vehicle group. The animals treated with AZ displayed a lower mortality rate 24 hours after SE, however there was an increase in the number of seizures, particularly for smaller stage (mainly Racine?s stage 2). The concentration of 2.5?M of AZ caused an inhibition on the intracellular calcium concentration in hippocampal slices of Saline rats after stimulation with BzATP. Nevertheless, this result did not occur in hippocampal slices Pilo+AZ+BzATP group, where we observed a significant increase in the concentration of calcium compared to saline group. Conclusion: AZ administration caused a significant reduction of the mortality rate, a reduction of P2X7R density, reduction of the cellular death in hippocampal formation and an increase of the intracellular calcium in the hippocampus in the acute period. In the chronic period, it cause an increase of the number of seizures, mainly the less severe ones, highlighting the role of P2X7R in epilepsy induced by pilocarpine. The heterogeneous responses induced by AZ indicate that new studies are necessary to elucidate mechanisms modulated by this antagonist.
Introdução: A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o tipo mais comum de epilepsia focal com crises frequentemente refratárias às drogas antiepilépticas, sendo a esclerose hipocampal (EH) a anormalidade estrutural mais comum. O modelo de epilepsia induzido por pilocarpina reproduz as principais características da ELT. A pilocarpina é um agonista colinérgico que administrada em altas doses via sistêmica, gera status epilepticus (SE), EH, reorganização sináptica e crises espontâneas e recorrentes. O SE induz alterações em sistemas neurotransmissores dentre eles os purinérgicos. Estudos mostram um aumento na expressão de subtipos de receptores purinérgicos P2X no modelo de ELT induzido por pilocarpina, e o aumento do receptor P2X7 (P2X7R) foi apontado como mecanismo que favorece a excitotoxicidade e a hiperexcitabilidade. O aumento da sinalização purinérgica é, portanto, uma das alterações causadas por crises e necessita de elucidação. O uso de antagonistas tem auxiliado o conhecimento dessa sinalização na epilepsia. Objetivos: Elucidar o papel dos P2X7R, através da administração do antagonista AZ-10606120 (AZ), no processo de morte celular hipocampal e na epileptogênese em animais submetidos ao modelo de epilepsia induzido por pilocarpina, e na mobilidade de cálcio em fatias hipocampais. Métodos: O AZ foi administrado por via intracerebroventricular (i.c.v.) nas doses 1?g, 2?g e 3?g, 30 minutos após SE, em animais submetidos ao modelo da pilocarpina e em controles, e o processo de morte celular hipocampal analisado por meio de Fluoro Jade-B (FJ-B). A dose que causou menor número de células FJ-B positivas foi selecionada para o estudo (3?g). Assim, quatro grupos foram estudados: Salina+Veículo, Salina+AZ, Pilo+Veículo, Pilo+AZ. A quantificação dos P2X7R foi analisada por Western Blot. Para o estudo do cálcio intracelular, foram empregadas fatias hipocampais de animais controle, que foram incubadas com o marcador de cálcio Fluo-4AM. Estas foram incubadas com AZ nas concentrações de 2,5?M, 5?M e 10?M ou salina, e estimuladas com BzATP. A concentração de AZ que causou menor taxa de cálcio intracelular (2,5?M) foi empregada nos grupos estudados: Salina+BzATP, Salina+AZ+BzATP, Pilo+BzATP e Pilo+AZ+BzATP. A avaliação comportamental foi realizada durante 30 dias a partir da indução do SE em animais submetidos ao modelo da pilocarpina ou salina, com ou sem administração de AZ. Resultados: A dose 3?g do AZ i.c.v. causou redução do número de células marcadas com FJ-B nas regiões de CA1, CA3 e hilo do giro dentado em ratos submetidos ao SE por pilocarpina. Essa dose também diminuiu a expressão dos P2X7R (-42%) nos animais do grupo Pilo+AZ quando comparados aos do grupo Pilo+Veículo. Os animais tratados com AZ apresentaram menor taxa de mortalidade 24 horas após o SE, porém houve um aumento no número de crises, principalmente nas de menor estadio (maioria com estadio 2 de Racine). A concentração de 2,5?M de AZ causou inibição na concentração de cálcio intracelular em fatias de hipocampo de ratos salina após estímulo com BzATP. No entanto, esse resultado não ocorreu em fatias hipocampais do grupo Pilo+AZ+BzATP onde observamos um aumento significante na concentração de cálcio comparado ao grupo Salina. Conclusão: A administração do AZ promoveu redução significativa da taxa de mortalidade, redução na expressão proteica dos P2X7R, redução da morte celular na formação hipocampal e um aumento de cálcio intracelular no hipocampo no período agudo. No período crônico, causou aumento no número de crises, principalmente de menor gravidade evidenciando o papel dos P2X7R na epilepsia induzida por pilocarpina. O quadro heterogêneo de respostas causadas pelo AZ indica que novos estudos são necessários para elucidar os mecanismos modulados por este antagonista.
Introdução: A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o tipo mais comum de epilepsia focal com crises frequentemente refratárias às drogas antiepilépticas, sendo a esclerose hipocampal (EH) a anormalidade estrutural mais comum. O modelo de epilepsia induzido por pilocarpina reproduz as principais características da ELT. A pilocarpina é um agonista colinérgico que administrada em altas doses via sistêmica, gera status epilepticus (SE), EH, reorganização sináptica e crises espontâneas e recorrentes. O SE induz alterações em sistemas neurotransmissores dentre eles os purinérgicos. Estudos mostram um aumento na expressão de subtipos de receptores purinérgicos P2X no modelo de ELT induzido por pilocarpina, e o aumento do receptor P2X7 (P2X7R) foi apontado como mecanismo que favorece a excitotoxicidade e a hiperexcitabilidade. O aumento da sinalização purinérgica é, portanto, uma das alterações causadas por crises e necessita de elucidação. O uso de antagonistas tem auxiliado o conhecimento dessa sinalização na epilepsia. Objetivos: Elucidar o papel dos P2X7R, através da administração do antagonista AZ-10606120 (AZ), no processo de morte celular hipocampal e na epileptogênese em animais submetidos ao modelo de epilepsia induzido por pilocarpina, e na mobilidade de cálcio em fatias hipocampais. Métodos: O AZ foi administrado por via intracerebroventricular (i.c.v.) nas doses 1?g, 2?g e 3?g, 30 minutos após SE, em animais submetidos ao modelo da pilocarpina e em controles, e o processo de morte celular hipocampal analisado por meio de Fluoro Jade-B (FJ-B). A dose que causou menor número de células FJ-B positivas foi selecionada para o estudo (3?g). Assim, quatro grupos foram estudados: Salina+Veículo, Salina+AZ, Pilo+Veículo, Pilo+AZ. A quantificação dos P2X7R foi analisada por Western Blot. Para o estudo do cálcio intracelular, foram empregadas fatias hipocampais de animais controle, que foram incubadas com o marcador de cálcio Fluo-4AM. Estas foram incubadas com AZ nas concentrações de 2,5?M, 5?M e 10?M ou salina, e estimuladas com BzATP. A concentração de AZ que causou menor taxa de cálcio intracelular (2,5?M) foi empregada nos grupos estudados: Salina+BzATP, Salina+AZ+BzATP, Pilo+BzATP e Pilo+AZ+BzATP. A avaliação comportamental foi realizada durante 30 dias a partir da indução do SE em animais submetidos ao modelo da pilocarpina ou salina, com ou sem administração de AZ. Resultados: A dose 3?g do AZ i.c.v. causou redução do número de células marcadas com FJ-B nas regiões de CA1, CA3 e hilo do giro dentado em ratos submetidos ao SE por pilocarpina. Essa dose também diminuiu a expressão dos P2X7R (-42%) nos animais do grupo Pilo+AZ quando comparados aos do grupo Pilo+Veículo. Os animais tratados com AZ apresentaram menor taxa de mortalidade 24 horas após o SE, porém houve um aumento no número de crises, principalmente nas de menor estadio (maioria com estadio 2 de Racine). A concentração de 2,5?M de AZ causou inibição na concentração de cálcio intracelular em fatias de hipocampo de ratos salina após estímulo com BzATP. No entanto, esse resultado não ocorreu em fatias hipocampais do grupo Pilo+AZ+BzATP onde observamos um aumento significante na concentração de cálcio comparado ao grupo Salina. Conclusão: A administração do AZ promoveu redução significativa da taxa de mortalidade, redução na expressão proteica dos P2X7R, redução da morte celular na formação hipocampal e um aumento de cálcio intracelular no hipocampo no período agudo. No período crônico, causou aumento no número de crises, principalmente de menor gravidade evidenciando o papel dos P2X7R na epilepsia induzida por pilocarpina. O quadro heterogêneo de respostas causadas pelo AZ indica que novos estudos são necessários para elucidar os mecanismos modulados por este antagonista.
Descrição
Citação
ARAUJO, Michelle Gasparetti Leao. Uso de antagonista farmacológico no estudo do papel do receptor p2x7 nas alterações causadas por crises induzidas por pilocarpina. 2015. 92 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.