Caracterização bioquímica da enzima antranilato fosforibosil transferase de cryptococcus neoformans
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Data
2015-09-12
Autores
Chagas, Rayane Arraes Jardim [UNIFESP]
Orientadores
Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele Alfonso [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
The number of patients with opportunist fungal diseases, e.g. criptococosis, has increased in recent years due to the higher occurrence of immunosuppressed patients. This phenomenon can be associated, for example, to the appearance of AIDS, to the utilization of new medical practices, like immunosuppressive therapies, and to the indiscriminate use of antimicrobial drugs. Nevertheless, the number of available antifungal drugs has remained sparse, mainly due to the low availability of new targets with highly selective toxicity, since the fungal cells are similar to the human ones, both eukaryotes. The tryptophan biosynthetic pathway is absent in human beings and past studies showed a decreasing virulence in microorganisms in which mutations caused the absence of the production of this amino acid. Thus, the study of this biosynthetic pathway is important to develop new drugs with high selective toxicity against fungal diseases. The tryptophan biosynthetic pathway is composed of five enzymes, which are: anthranilate synthase, anthranilate phosphoribosyltransferase, phosphoribosyl anthranilate isomerase, indole-3-glycerol phosphate synthase, and tryptophan synthase. In the human-pathogen model Cryptococcus neoformans, the gene APRT codifies the anthranilate phosphoribosyltransferase enzyme, which, in turn, catalyzes the second step of this pathway, catalyzing the transfer of the phosphoribosyl group of phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) to anthranilate , thus forming phosphoribosyl anthranilate. Therefore, the aim of this work was to clone, to express, and to purify in a recombinant form this pathogenic organism?s enzyme and to analyze its activity through fluorescence assay. Activity of the enzyme was verified by a Michaelis-Menten kinetic. Hence, it was possible to obtain the following constants: Km = 1,3995 ?M ± 0,6 ?M for anthranilate, Km = 0,3745 mM ± 0,14 mM for PRPP, and kcat = 0,0037s-1 ± 0,0005s-1. Biochemical characterization of this enzyme will enable future chemical compounds screens to find specific inhibitors. This, in turn, will allow the development of new techniques against this opportunist pathogen, thus demonstrating the expected impact of this applied research area.
O número de pacientes acometidos por doenças fúngicas oportunistas, como a criptococose, aumentou devido a maior ocorrência de pacientes imunossuprimidos. Este fenômeno pode ser associado, por exemplo, ao surgimento da AIDS, à utilização de novas práticas médicas, como terapias imunossupressoras, e ao uso indiscriminado de antimicrobianos. Entretanto, o quadro de antifúngicos disponíveis permaneceu escasso, devido principalmente à baixa disponibilidade de novos alvos com alta toxicidade seletiva, uma vez que as células fúngicas se assemelham com as células humanas, ambas eucariotas. A via de biossíntese do triptofano é ausente nos seres humanos e estudos evidenciaram uma diminuição da virulência de microrganismos com mutações que levam à ausência da produção deste aminoácido. Portanto, seu estudo é de considerável importância no desenvolvimento de novas drogas com alta toxicidade seletiva contra doenças fúngicas. A via de biossíntese do triptofano é composta por cinco enzimas, sendo elas: antranilato sintase, antranilato fosforibosil transferase, fosforibosil-antranilato isomerase, indol-glicerol-3-fosfato sintase e a triptofano sintase. No organismo modelo humano-patogênico Cryptococcus neoformans, o gene APRT codifica a enzima antranilato fosforibosil transferase, que, por sua vez, catalisa o segundo passo dessa via promovendo a transferência do grupo fosforibosil para o antranilato na presença de fosforibosil pirofosfato (PRPP), o que leva à produção do fosforibosil antranilato. Diante disso, o intuito desse trabalho foi clonar, expressar e purificar de forma recombinante esta enzima deste organismo patogênico e analisar a sua atividade através de ensaios de fluorescência. A enzima demonstrou seguir uma cinética de Michaelis-Menten, sendo possível obter as seguintes constantes: Km = 1,3995 ?M ± 0,6 ?M para o antranilato, Km = 0,3745 mM ± 0,14 mM para o PRPP e kcat = 0,0037s-1 ± 0,0005s-1. Com a caracterização dessa enzima, será possível estabelecer futuros ensaios de varredura de compostos químicos para encontrar inibidores específicos. Isto, por sua vez, possibilitará o desenvolvimento de novas terapias contra este patógeno oportunista, o que demonstra o impacto esperado para esta área de pesquisa aplicada.
O número de pacientes acometidos por doenças fúngicas oportunistas, como a criptococose, aumentou devido a maior ocorrência de pacientes imunossuprimidos. Este fenômeno pode ser associado, por exemplo, ao surgimento da AIDS, à utilização de novas práticas médicas, como terapias imunossupressoras, e ao uso indiscriminado de antimicrobianos. Entretanto, o quadro de antifúngicos disponíveis permaneceu escasso, devido principalmente à baixa disponibilidade de novos alvos com alta toxicidade seletiva, uma vez que as células fúngicas se assemelham com as células humanas, ambas eucariotas. A via de biossíntese do triptofano é ausente nos seres humanos e estudos evidenciaram uma diminuição da virulência de microrganismos com mutações que levam à ausência da produção deste aminoácido. Portanto, seu estudo é de considerável importância no desenvolvimento de novas drogas com alta toxicidade seletiva contra doenças fúngicas. A via de biossíntese do triptofano é composta por cinco enzimas, sendo elas: antranilato sintase, antranilato fosforibosil transferase, fosforibosil-antranilato isomerase, indol-glicerol-3-fosfato sintase e a triptofano sintase. No organismo modelo humano-patogênico Cryptococcus neoformans, o gene APRT codifica a enzima antranilato fosforibosil transferase, que, por sua vez, catalisa o segundo passo dessa via promovendo a transferência do grupo fosforibosil para o antranilato na presença de fosforibosil pirofosfato (PRPP), o que leva à produção do fosforibosil antranilato. Diante disso, o intuito desse trabalho foi clonar, expressar e purificar de forma recombinante esta enzima deste organismo patogênico e analisar a sua atividade através de ensaios de fluorescência. A enzima demonstrou seguir uma cinética de Michaelis-Menten, sendo possível obter as seguintes constantes: Km = 1,3995 ?M ± 0,6 ?M para o antranilato, Km = 0,3745 mM ± 0,14 mM para o PRPP e kcat = 0,0037s-1 ± 0,0005s-1. Com a caracterização dessa enzima, será possível estabelecer futuros ensaios de varredura de compostos químicos para encontrar inibidores específicos. Isto, por sua vez, possibilitará o desenvolvimento de novas terapias contra este patógeno oportunista, o que demonstra o impacto esperado para esta área de pesquisa aplicada.
Descrição
Citação
CHAGAS, Rayane Arraes Jardim. Caracterização bioquímica da enzima antranilato fosforibosil transferase de cryptococcus neoformans. 2015. 50 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São José dos Campos, 2015.