Atividade antitumoral de derivados do benzofuroxano in vitro e in vivo: mecanismo de ação dos compostos n-br e n-i na indução da apoptose em células de melanoma murino b16f10-nex2
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Data
2015-05-31
Autores
Farias, Camyla Fernandez de [UNIFESP]
Orientadores
Travassos, Luiz Rodolpho Raja Gabaglia Travassos [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Malignant melanoma is a very aggressive and lethal type of skin cancer that is largely resistant to conventional therapies in metastatic stages. In vitro and in vivo experiments have shown that tumor cells rely on higher levels of reactive oxygen species (ROS) to survive, and many chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin and anthracyclines, are based in this mechanism to exert their antitumor activity, inducing intolerant levels of ROS in tumor cells. The nifuroxazide, a compound that belongs to 5-Nitrofuran class, is used in infectious diseases and several toxic side effects have been related. 23 Analogues derived from the replacement of this radical to benzofuroxan, a radical known to induce generation of ROS, were used in the present study to evaluate their cytotoxic and antitumor activity against malignant melanoma and different human tumor cell lines, such as melanoma (A2058), cervical carcinoma (Hela), breast cancer (MCF-7), ovarian cancer (Ovcar-3) and glioblastoma (U87). We observed that all benzofuroxan analogues showed cytotoxic effects against murine melanoma cells, especially the N-Br and N-I analogues, which were significant active against most of human tumor cell lines and showed significant protection against subcutaneous and metastatic melanoma in vivo, using immunocompetent and immunosuppressed models. We observe that N-Br and N-I analogues induce apoptosis in treated cells, as evidenced by the formation of blebs in the plasma membrane, DNA condensation, fragmentation of nucleosomal in a ladder pattern in agarose gel and induction of phosphatidylserine externalization on the plasma membrane. We found that apoptosis induced by N-Br and N-I occurs mainly by the intrinsic mitochondrial pathway in melanoma B16F10-Nex2 cells, since these compounds significantly reduced the integrity of the outer membrane potential in mitochondria. Subsequently, we identified that both compounds induced caspase 9 and 3 activation, followed by cleavage of PARP. We observed that the mechanism by which these compounds induces their cytotoxic effects on B16F10-Nex2 cells is through the generation ROS, and cellular cytotoxicity was inhibited by pre-incubation of the cells with N-acetyl-cysteine (NAC), thus reverting many of the observed effects. Finally, we found that the induction of ROS by N-Br and N-I resulted in the inhibition of AKT activation, an important molecule related to cell survival, followed by upregulation of BIM, a protein related with the the intrinsic apoptosis echanism. We conclude that benzofuroxan derivatives N-Br and N-I are very promising agents for cancer treatment, and may be considered for malignant melanoma therapy as inducers of intrinsic apoptosis in these cells, besides having significant antitumor potential against metastatic melanoma in vivo when systemically administered in animals bearing lung metastases.
O melanoma maligno é um câncer de pele de alta letalidade e agressividade com poucos recursos terapêuticos em sua fase metastática. Estudos in vitro e in vivo mostram que as células tumorais dependem de níveis mais elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS) para sobreviver, e muitos quimioterápicos utilizam desta característica para exercerem sua atividade antitumoral, elevando os níveis de ROS à quantidades acima do suportado pelas células tumoral como é o caso da antraciclinas, como a doxorubicina. O nifuroxazide é um antibiótico utilizado em doenças infecciosas da classe 5-Nitrofuran e que apresenta diversos efeitos colaterais tóxicos. Vinte e três análogos derivados da substituição deste radical pelo benzofuroxano, um radical conhecido por atuar na geração de ROS, foram utilizados no presente trabalho para avaliação de sua atividade citotóxica e antitumoral contra o melanoma e diferentes linhagens tumorais humanas, tais como melanoma (A2058), carcinoma cervical (Hela), cancer de mama (MCF-7), carinoma de ovário (Ovcar-3) e glioblastoma (U87). Observamos que todos os compostos apresentam um potencial citotóxico contra células de melanoma murino B16F10-Nex2, com destaque para os análogos N-Br e N-I. Esses análogos foram os mais ativos contra o a maioria das linhagens tumorais humanas além de apresentarem significativa proteção contra o melanoma metastático e subcutâneo in vivo, tanto em animais imunocompetentes quanto em animais imunossuprimidos. Observamos que os análogos N-Br e N-I induzem apoptose nas células tratadas, evidenciada pela formação de ?blebs? na membrana plasmática, condensação do DNA, fragmentação nucleossomal no padrão de escada em gel de agarose e indução da externalização de fosfatidilserina na membrana plasmática. Verificamos que a apoptose induzida por N-Br e N-I ocorre pela via intrínseca mitocondrial em células de melanoma B16F10-Nex2, visto que estes compostos reduziram significativamente a integridade do potencial de membrana externa da mitocôndria. Posteriormente, identificamos ativação de caspase 9, 3 e clivagem de PARP no tratamento induzido pelos compostos. Verificamos que o mecanismo pelo qual estes compostos induzem seu efeito citotóxico nas células B16F10-Nex2 é decorrente da geração de ROS nestas células, e a citotoxicidade celular foi inibida mediante a pré-incubação das células com N-acetil-cisteína (NAC), anulando assim diversos fenômenos até aqui observados. Por fim, verificamos que a indução de ROS pelos análogos N-Br e N-I resultou na regulação da ativação de AKT, um importante componente da sobrevivência celular, seguido do aumento da expressão de BIM, um importante componente de progressão da via intrínseca da apoptose. A capacidade de induzir apoptose intrínseca, associado ao efeito contra melanoma in vivo torna os derivados N-Br e N-I estruturas promissoras para o tratamento do melanoma maligno abrindo uma nova possibilidade terapêutica.
O melanoma maligno é um câncer de pele de alta letalidade e agressividade com poucos recursos terapêuticos em sua fase metastática. Estudos in vitro e in vivo mostram que as células tumorais dependem de níveis mais elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS) para sobreviver, e muitos quimioterápicos utilizam desta característica para exercerem sua atividade antitumoral, elevando os níveis de ROS à quantidades acima do suportado pelas células tumoral como é o caso da antraciclinas, como a doxorubicina. O nifuroxazide é um antibiótico utilizado em doenças infecciosas da classe 5-Nitrofuran e que apresenta diversos efeitos colaterais tóxicos. Vinte e três análogos derivados da substituição deste radical pelo benzofuroxano, um radical conhecido por atuar na geração de ROS, foram utilizados no presente trabalho para avaliação de sua atividade citotóxica e antitumoral contra o melanoma e diferentes linhagens tumorais humanas, tais como melanoma (A2058), carcinoma cervical (Hela), cancer de mama (MCF-7), carinoma de ovário (Ovcar-3) e glioblastoma (U87). Observamos que todos os compostos apresentam um potencial citotóxico contra células de melanoma murino B16F10-Nex2, com destaque para os análogos N-Br e N-I. Esses análogos foram os mais ativos contra o a maioria das linhagens tumorais humanas além de apresentarem significativa proteção contra o melanoma metastático e subcutâneo in vivo, tanto em animais imunocompetentes quanto em animais imunossuprimidos. Observamos que os análogos N-Br e N-I induzem apoptose nas células tratadas, evidenciada pela formação de ?blebs? na membrana plasmática, condensação do DNA, fragmentação nucleossomal no padrão de escada em gel de agarose e indução da externalização de fosfatidilserina na membrana plasmática. Verificamos que a apoptose induzida por N-Br e N-I ocorre pela via intrínseca mitocondrial em células de melanoma B16F10-Nex2, visto que estes compostos reduziram significativamente a integridade do potencial de membrana externa da mitocôndria. Posteriormente, identificamos ativação de caspase 9, 3 e clivagem de PARP no tratamento induzido pelos compostos. Verificamos que o mecanismo pelo qual estes compostos induzem seu efeito citotóxico nas células B16F10-Nex2 é decorrente da geração de ROS nestas células, e a citotoxicidade celular foi inibida mediante a pré-incubação das células com N-acetil-cisteína (NAC), anulando assim diversos fenômenos até aqui observados. Por fim, verificamos que a indução de ROS pelos análogos N-Br e N-I resultou na regulação da ativação de AKT, um importante componente da sobrevivência celular, seguido do aumento da expressão de BIM, um importante componente de progressão da via intrínseca da apoptose. A capacidade de induzir apoptose intrínseca, associado ao efeito contra melanoma in vivo torna os derivados N-Br e N-I estruturas promissoras para o tratamento do melanoma maligno abrindo uma nova possibilidade terapêutica.
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FARIAS, Camyla Fernandez de. Atividade antitumoral de derivados do benzofuroxano in vitro e in vivo: mecanismo de ação dos compostos n-br e n-i na indução da apoptose em células de melanoma murino b16f10-nex2. 2015. 50 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.