Purificacao, caracterizacao estrutural e funcional de uma lectina de bauhinia forficata
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Date
2012
Authors
Silva, Mariana Cristina Cabral [UNIFESP]
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Tese de doutorado
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Abstract
Uma nova lectina, BfL, foi purificada de sementes de Bauhinia forficata por fracionamento com sulfato de amonio, cromatografias de troca ionica em DEAESephadex, afinidades em Sepharose-4B e quitina, e exclusao molecular em Superdex 75. A homogeneidade da preparacao foi avaliada pela cromatografia de fase reversa, utilizando o sistema HPLC. A massa molecular determinada pelo LC/ESI-MS e de 27.850 Da. BfL e uma glicoproteina com conteudo de carboidrato de 6,24%. Fetuina, asialofetuina, tiroglobulina e azocaseina inibiram a atividade hemaglutinante de BfL, enquanto carboidratos nao. A atividade hemaglutinante de BfL e termo-estavel (em 100ºC por 30 min), pH dependente (a maior atividade foi obtida em pH 6,0) e nao e dependente de ions. A estrutura primaria de BfL mostra similaridade com outras lectinas do genero Bauhinia. Desconvolucao do espectro de dicroismo circular (DC) indicou a presenca de estruturas helices-α e β. BfL prolonga o tempo de coagulacao, provavelmente por interagir com o fator XIa. BfL tambem inibe a agregacao plaquetaria induzida por ADP e adrenalina, sendo a unica lectina de Bauhinia isolada que mostra propriedades anticoagulantes e antiagregantes plaquetaria. BfL inibiu a viabilidade das celulas de cancer de mama humano da linhagem MCF-7, determinado pelo metodo do MTT, mas foi ineficaz na linhagem MDA-MB 231. BfL inibiu a adesao das celulas da linhagem MCF-7 a laminina, colageno tipo I e fibronectina. Analise de imunodeteccao (oWestern blottingo) mostrou uma diminuicao significativa da expressao das integrinas α6 e β1 e aumento de expressao da integrina α5. Morte celular de MCF-7 ocorreu apos 24 e 48 h na presenca de BfL (5 μM), como analizado pelo citometro de fluxo utilizando marcacao dupla de anexina V-FITC/PI, corroborando com o aumento da expressao da proteina pro-apoptotica Bax. BfL acarreta parada do ciclo celular na fase G2/M, com diminuicao da expressao das proteinas reguladoras pRb e p21, e fragmentacao do DNA nuclear, pela tecnica do TUNEL. Estes resultados sugerem que BfL pode ser empregada para os estudos de modelos de trombose e cancer
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São Paulo: [s.n.], 2012. 230 p.