PPG - Biologia Química

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https://hdl.handle.net/11600/61107

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Navegando PPG - Biologia Química por Palavras-chave "2D and 3D culture"

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    Acesso aberto (Open Access)
    Engenharia de vetores expressando o receptor de TGFβ1 tipo II solúvel sob controle do promotor NF-kB e análise da expressão em culturas musculares 2D e 3D
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-07-24) Sales, Sofia Mila Cantu [UNIFESP]; Stilhano, Roberta Sessa; http://lattes.cnpq.br/2122125365795721; http://lattes.cnpq.br/7344894651433108
    Introdução: O TGF-β1 (Transforming growth factor beta 1) é um fator importante na cicatrização e formação de fibrose, cuja inibição é terapeuticamente relevante em lesões com perda muscular significativa. No presente trabalho, foi avaliada a funcionalidade do vetor lentiviral carreando o receptor solúvel de TGFβ (sTGFβRII) juntamente com o promotor induzível pelo NF-kB (fator de transcrição nuclear ligado na cadeia leve kappa das células B), que é altamente expresso durante a fase inflamatória da lesão muscular, em modelos de lesão 2D e 3D de células musculares. Objetivo: Desenvolvimento de vetores expressando o receptor de TGF-β1 tipo II solúvel sob o controle do promotor NF-kB e a avaliação da expressão em culturas musculares 2D e 3D. Metodologia: Células C2C12 foram transduzidas com vetores 1 (NFkb_Luciferase) ou 3 (NFkB_sTGβFRII). Essas linhagens produzidas foram cultivadas com meio DMEMc (Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM; 10% de soro fetal bovino (SFB); 1% Penicilina/estreptomicina (P/S)). Os esferoides de MDSC (muscle derived-stem cells) e C2C12 foram produzidos em micromoldes de agarose e cultivados com os meios de proliferação (PM) (Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM; 10% de soro fetal bovino (SFB); 10% de soro de cavalo (SC); 1% Penicilina/estreptomicina (P/S); 0,5% de extrato de embrião de galinha) e com o meio de diferenciação (DM) (DMEM; 10% SFB; 1% P/S). Foram produzidos também esferoides das linhagens 1 e 3. A caracterização dos esferoides foi realizada por diversos ensaios: viabilidade por citometria de fluxo (7AAD e Anexina V), CellTiter-Glo, live and dead (calceína e 7AAD) e MTT. Histologia em historresina com coloração de azul de toluidina, imuno-histoquímica e imunofluorescência para os marcadores MyoD, Pax7 e eMyHC e a criação do modelo de lesão com cloreto de bário (BaCl2) e cardiotoxina (CTX). Resultados: Nos ensaios 2D, observamos uma modulação da expressão gênica do sTGFβRII e luciferase na presença de BaCl2. Caracterizamos esferoides de MDSC e C2C12 com forma e tamanho homogêneos tanto no meio padrão de cultivo quanto no meio de DM. A viabilidade dos esferoides do grupo PM foi alta (88% no 2º dia e 74% no 14º dia), enquanto a viabilidade do grupo DM diminuiu para 44%, e a porcentagem de células apoptóticas aumentou para 56% no 14º dia. Na análise da morfologia, observamos um aumento de células fusiformes, especialmente no grupo DM, sugerindo a diferenciação. Também houve um aumento significativo na intensidade de fluorescência de eMyHC (7,5X), Pax-7 (2,1X) e MyoD (2X) em relação ao grupo PM no dia 14. O grupo PM mostrou uma capacidade de proliferação 5X maior que o grupo DM após o 4º dia, tanto em número total de células quanto nas células aderidas à placa. Os esferoides cultivados em meio PM também apresentaram uma maior capacidade de proliferação e fusão quando comparados ao meio DM. Nos esferoides C2C12, observamos um crescimento exponencial com um platô a partir do dia 14 em relação ao volume, e uma diminuição do volume do centro necrótico a partir do 4º dia. Na padronização do modelo de lesão por CTX e BaCl2, observamos uma redução na viabilidade dos esferoides em todos os grupos quando comparados ao controle (CTL) (p<0,05), exceto no grupo BaCl2 6,25%. As concentrações de BaCl2 de 50%, 12,5% e 6,25%, e CTX (1µM) apresentaram viabilidades de 27%, 53%, 74% e 24%, respectivamente. A lesão induzida com BaCl2 50% levou a uma redução de 60,5% do volume do esferoide (p<0,05) e 54% da viabilidade (p<0,05) em comparação com o grupo controle. Esferoides das linhagens 1 e 3 mostraram uma redução do tamanho dos esferoides da linhagem 3 (p<0,05), sugerindo a importância do TGF-β1 para a proliferação celular e a possibilidade de sua depleção do meio de cultura. Também observamos uma redução na viabilidade dos esferoides que superexpressaram o sTGFβRII (p<0,05). No modelo transwell, verificamos que o receptor solúvel foi expresso e teve um efeito nas células C2C12, reduzindo sua viabilidade frente à lesão com BaCl2. Conclusão: foi possível produzir e caracterizar esferoides de células musculares usando a técnica de micromoldes de agarose scaffold-free. Observamos que as células MDSC foram capazes de se diferenciar ao longo do tempo, apresentando maior expressão de marcadores miogênicos no meio DM. Além disso, desenvolvemos um modelo de lesão em esferoides de células C2C12 utilizando BaCl2 e CTX, o qual resultou em redução da viabilidade e alteração no volume dos esferoides. Demonstramos que o receptor solúvel foi expresso e modulado por BaCl2, no entanto, sua expressão levou a uma diminuição no tamanho e na viabilidade dos esferoides. Embora sejam necessários estudos adicionais para compreender o efeito do receptor solúvel na redução da fibrose, nosso estudo evidenciou sua funcionalidade e modulação na presença de agentes indutores de lesão muscular, como o BaCl2.