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    Papel da angiotensina ii na expressão gênica do receptor de (pro) renina em células mesangiais em cultura
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-07-31) Pereira, Luciana Guilhermino [UNIFESP]; Boim, Mirian Aparecida Boim [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O receptor de renina/prorenina (RRP) constitui um novo componente ativo do Sistema Renina-Angiotensina (SRA) contribuindo para aumentar a síntese local de AII e ativar a via pró-fibrótica mediada pelas quinases ERKs1/2. Em trabalho anterior mostramos que o losartan reduziu a expressão do RRP em células mesangiais (CMs) estimuladas com glicose indicando uma possível relação entre a AII e a expressão do RRP. Para avaliar se este efeito supressor da AII foi devido a sua ação intracelular, comparamos o efeito de diferentes bloqueadores dos receptores AT1 (BRA), o Losartan e o Candesartan, uma vez que apenas o losartan pode ser internalizado em associação ao AT1, enquanto que o candesartan permanece preso ao receptor na superfície celular. Avaliamos o efeito desses bloqueadores sobre a expressão do RRP, dos componentes do SRA e fosforilação de ERK. CMs em cultura foram incubadas por 24 horas, de acordo com os grupos: Controle (CTL-10mM glicose); alta glicose (GL-30mM); alta glicose na presença de 100nM de Losartan (GL+Los) ou 1µM de Candesartan (GL+Cand). As expressões de RNAm para RRP, fibronectina e ?-actina foram determinadas através de PCR em tempo real. Expressão de ERK, p-ERK e prorenina foi estimada por Western blot. Níveis de AII no meio de cultura e no lisado celular foram quantificados por HPLC. A estabilidade do RNAm do RRP foi avaliada por PCR em tempo real após a inibição da transcrição pela actinomicina D. A atividade de dois sítios de ligação na região promotora do gene codificador de RRP com fatores de transcrição estimulados pela AII, o NF-?B e o AP-1, foi avaliada através de inibidores específicos (quinazolina e curcumina respectivamente). O bloqueio da síntese de AII pela célula mesangial foi feito com o silenciamento do gene do Angiotensinogênio com RNA de interferência. A glicose aumentou o conteúdo de AII intracelular, a expressão de RRP, p-ERK/ERK, prorenina e fibronectina. Losartan foi capaz de reverter completamente esses efeitos enquanto que o Candesartan reverteu o aumento da AII, do RRP e da fibronectina mas não reverteu o aumento da prorenina e, consequentemente, da ativação da via da ERK. A estabilidade do RNAm de RRP não foi alterada com o tratamento com glicose. A inibição do NF-?B, mas não do AP-1, reduziu a expressão do RRP. O bloqueio do angiotensinogênio pelo RNA de interferência causou aumento do RRP e da ativação da via do NF-?B. Esses resultados sugerem que: 1) Os BRA capazes de inibir a ação intracelular da AII (Los) podem ser potencialmente mais efetivos para reduzir a atividade do SRA por um mecanismo envolvendo a supressão do gene do RRP; 2) A AII intracelular parece ter uma participação direta na regulação do gene do RRP mas sua ausência provavelmente dispara outros mecanismos compensatórios para essa regulação.
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    Acesso aberto (Open Access)
    O papel dos receptores AT1 na hipertensão induzida por Angiotensina II: análise do perfil de ativação das vias de sinalização e dos complexos mitocondriais em células mesangiais; e avaliação da resposta pressórica e natriurética - de camundongos knockout para receptores AT1 no túbulo proximal
    (Universidade Federal de São Paulo, 2020-02-19) Leite, Ana Paula de Oliveira [UNIFESP]; Casarini, Dulce Elena [UNIFESP]; Zhuo, Jia Long [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0534906942293338; http://lattes.cnpq.br/9781219530171420; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A desregulação do Sistema renina angiotensina aldosterona é um dos fatores chaves na hipertensão arterial sistêmica (HAS). Os tratamentos com losartan, bloqueador do receptor AT1 além de melhorar diminuir a pressão arterial (PA) melhora as lesões de órgão alvo, entretanto em alguns pacientes, os efeitos do bloqueador não são tão eficientes. As células mesangiais glomerulares (CM) e o túbulo proximal são alvo da ação da angiotensina II (ANG II) e estão relacionados com lesão de órgão alvo em patologias como a HAS. O aumento da formação de ANGII nas CM pode causar lesão glomerular, promovendo o crescimento celular, hipertrofia e fibrose. Investigamos a sinalização de proteínas fosforiladas e as respostas mitocondriais à ANG II parácrina ou intracelular em CM de murinos (in vitro) e avaliamos a função renal do receptor AT1 em camundongos nocaute para este receptor no túbulo proximal (in vivo). Métodos: As CM foram cultivadas em meio DMEM e Ham's F-12, com 80% de confluência, carenciadas de soro fetal bovino. As células foram tratadas com ANG II na ausência ou presença de inibidores dos receptores AT1 (losartan) e/ou AT2 (PD 123319). As proteínas p-PKCα, p-ERK1/2, p38, p65 e p50 de NF-кB foram analisadas por Western Blotting (WB). As CM, foram submetidas ao processo de transfecção com vetores adenovirais que codificam uma proteína de fusão intracelular de ANG II, a mito-ECFP-ANG II, tratadas com Losartan ou com dupla transfecção com mito-GFP-AT2, para análise complexos mitocondriais proteicos I a V por WB. Os animais nocaute para o receptor AT1 no túbulo proximal e os animais selvagem, de ambos os sexos foram divididos em doze grupos (n=8/grupo), C57BL/6J (C57, selvagem) e mutantes (PT-AT1 -/-, PT). Esses aninais foram infundidos com ANG II por meio de bomba osmótica por 2 semanas (40 ng / min, i.p.), tratados simultaneamente com losartan (20 mg/kg/dia, v.o.) para estudar os papéis do AT1 extrarrenal e no túbulo proximal. Esses animais tiveram a PA verificada via caudal e submetidos a gaiola metabólica para a analise de Na+, Cl- e K+ na urina. Foi realizada a análise histológica do rim esquerdo de machos para observação da deposição de colágeno. A ANG II aumentou significativamente a expressão de p-ERK1/2, p-PKCα, p38 e NF-kb e essas respostas foram atenuadas pelo losartan e/ou PD123319. O mito-ECFP/ANG II aumentou o complexo proteico mitocondrial I a V, o qual foi atenuado pelo losartan ou pela expressão de receptores mito-AT2. A PA foi aproximadamente 13 ± 3 mmHg mais baixa nos camundongos PT-AT1-/- do que nos animais C57. A excreção (24 h) basal de Na+ (UNaV), K+ (UKV) e Cl- urinária (UClV) foi significativamente mais alta nos camundongos PT-AT1a-/- do que nos controles C57. As respostas pressoras frente à ANG II ocorreram de forma semelhante entre C57 e nocaute. Com relação as avaliações metabólicas, em animais C57, a ANG II promoveu a diurese, a ingestão de água, UNaV, UClV e UKV, sendo que a diurese foi atenuada pelo losartan sem alterar os níveis de ions. Já nos animais nocaute, a excreção basal de sódio foi maior do que nos animais C57, a infusão de ANG II promoveu diurese, mas menos que C57, aumentou da ingestão de água e promoveu UNaV, UClV e UKV, sendo que o losartan atenuou todas esses parâmetros. Não há diferenças significativas entre os sexos nas respostas pressoras e natriuréticas à ANG II em animais C57 e PT-AT1-/-. Com relação a deposição de colágeno, a lesão renal induzida por Ang II foi atenuado em camundongos PT-Agtr1a-/- comparado com C57. Em conjunto, temos in vitro que a ativação da ANG II intracelular ocorreu através da ação em ambos os receptores nas células mesangiais e na mitocôndria. E em in vivo, o presente estudo demonstra que a deleção dos receptores AT1a nos túbulos proximais do rim atenua hipertensão induzida por Ang II e lesão renal sem diferença significativa entre os sexos. Em conclusão, podemos afirmar que nos túbulos proximais, esta ação da ANG II na hipertensão e manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico se dá principalmente através do AT1, já que na ausência deste receptor foi observada uma proteção renal frente aos efeitos deletérios da hipertensão.