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    Anticorpos monoclonais dirigidos a antígenos lipídicos estágio-específicos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006-12-31) Peder, Leyde Daiane de [UNIFESP]; Straus, Anita Hilda [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes.
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    Coccidiose em bagres estuarinos bioindicadores Cathorops spixii (Siluriformes, Ariidae) do litoral Paulista, SP, Brasil
    (Universidade Federal de São Paulo, 2019-12-02) Ferreira, Barbara da Silva [UNIFESP]; Azevedo, Juliana de Souza [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9196997953777495; http://lattes.cnpq.br/6292565394825772
    O estuário de Santos/São Vicente (SSV), localizado no litoral do estado São Paulo, sofre com as atividades antropogênicas devido a urbanização e as diversas indústrias que ali residem. Por outro lado, o Complexo estuarino-lagunar de Cananeia-Iguape (CELCI), também no litoral paulista, possui características onde o ambiente e as atividades econômicas da região visam ser sustentáveis, preservando os recursos naturais local. Sob estas perspectivas, o presente estudo tem como objetivo comparar a intensidade e padrão de infecção dos cistos de Calyptospora e parasitos vermiformes dispersos nos hepatócitos (HP) e/ou aderidos aos melanomacrófagos (MM) do tecido hepático de bagres da espécie Cathorops spixii, amplamente utilizada nos últimos anos como espécie bioindicadora de contaminação ambiental, a partir de uma avaliação temporal entre os anos de 2009 e 2014. Além disso, o grau de trofia hepática e o bem-estar dos indivíduos foram considerados, a partir da análise do índice hepatossomático (IHS) e o fator de condição de Fulton (FC), auxiliando na caracterização da qualidade dos ecossistemas estuarinos. Os cistos de Calyptospora foram identificados e quantificados através de categorias percentuais que está associada a frequência destes quando aderidos ao MM ou quando dispersos no hepatócito, bem como a quantidade de parasitos vermiformes que também foram contabilizados. De maneira geral, não foram observadas diferenças significativas quanto ao bem-estar dos peixes quanto ao estuário. Entretanto, bagres do setor mais ao norte do CELCI apresentaram menor FC, que pode estar associado a influência antropogênica na região. A frequência de parasitismo por Calyptospora foi mais significativa em SSV no ano de 2009, em que atingiu seu ápice no MM (53,1%), e a menor frequência no CELCI em 2009 (6,7%). Os bagres de SSV também apresentaram um maior valor médio de MM quando comparado aos peixes do CELCI. Portanto, a influência antrópica e estressores ambientais, como a salinidade podem facilitar a ocorrência de Calyptospora, visto que os peixes de SSV apresentaram uma maior expressão de parasitos, porém no CELCI os peixes estavam infectados por Calyptospora no HP. A presença do parasito em C. spixii e a contagem de MM pode estar atrelada a à poluição do ambiente e diferentes condições da hidroquímica, sugerindo, assim, sua eficiência como uma ferramenta para os trabalhos de biomonitoramento e diagnóstico ambiental em áreas estuarinas.
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    Imunização genética contra infecção experimental por Leishmania (Viannia) braziliensis
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006) Salay, Gerson [UNIFESP]; Rodrigues, Mauricio Martins [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A Leishmania (Viannia) braziliensis é o agente etiológico de mais de 90% dos casos de leishmanioses cutânea e mucocutânea no Brasil. Apesar da alta freqüência no Brasil, poucos estudos de vacinação estão descritos utilizando esta espécie de Leishmania. Com intuito de iniciar os estudos de vacinação experimental contra as leishmanioses cutânea e mucocutânea causada por L. (V.) braziliensis, isolamos os genes que codificam os antígenos LACK, TSA, LeIF e LbSTI1 desta espécie. Os genes foram caracterizados segundo sua seqüência de DNA e transcrição de mRNA nas diferentes formas do parasita. Observamos alta conservação na seqüência predita de aminoácidos quando comparamos as espécies L. (V.) braziliensis e L. (L.) major com identidades de 83% a 96%. Observamos também a presença de mRNA tanto nas formas promastigotas como amastigotas de L. (V.) braziliensis. Em seguida, inserimos estes genes em vetores para expressão em células eucarióticas e procarióticas. As proteínas recombinantes bacterianas foram inicialmente utilizadas para imunização de camundongos. Os anticorpos específicos foram utilizados para confirmar a expressão destes antígenos nas formas promastigotas e amastigotas de L. (V.) braziliensis. Posteriormente, observamos que a imunização de camundongos com plasmídios e proteínas recombinantes dos respectivos antígenos, induziu a produção de anticorpos específicos, com diferenças na magnitude e tipos de subclasse de anticorpo, assim como linfócitos produtores de IFN-γ. Por fim, analisamos a imunidade protetora após o desafio com formas promastigotas de L. (V.) braziliensis. Observamos que a resposta imune desencadeada pela imunização não foi suficiente para reduzir a lesão primária da infecção experimental. Desta parte de nossos estudos concluímos que: i) os quatro antígenos por nós clonados de L. (V.) braziliensis possuem potencial para utilização em estratégias de imunização contra infecção experimental por parasitas do gênero Leishmania; ii) as diferentes estratégias de imunização utilizadas não foram capazes de induzir significativa imunidade contra a infecção experimental com L. (V.) braziliensis. Em paralelo, estudamos o papel da molécula “glucocorticoid-induced tumor necrosis factor family-related receptor” (GITR) durante a infecção experimental com L. (L.) major. Inicialmente, observamos que camundongos geneticamente deficientes que não expressam a molécula GITR foram mais resistentes à infecção, quando comparados ao grupo de animais selvagens. Este aumento na resistência correlacionou com o aumento no número de células T CD4+ produtoras de IFN-γ presente no sítio de infecção. Complementamos estes experimentos, estudando o efeito do tratamento com anticorpos anti-GITR nesta infecção. Observamos que o tratamento com este anticorpo levou a diminuição do número de parasitas no sítio da lesão quando comparado ao grupo controle de animais. Este fenômeno foi correlacionado com a quantidade de IFN-γ produzida por células do linfonodo de drenagem. Destes experimentos pudemos concluir que a molécula GITR tem um papel crítico durante a leishmaniose cutânea causada por L. (L.) major, e que anticorpos anti-GITR tem um potencial para serem utilizados em estratégias de vacinação contra a leishmaniose cutânea potencializando a resposta imune específica.