Navegando por Palavras-chave "Oxacilinases"

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    Avaliação comparativa de distintos métodos fenotípicos para a detecção de cepas produtoras de carbapenemases
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-08-22) Moura, Jhonatha Rodrigo Cordeiro de [UNIFESP]; Gales, Ana Cristina [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8402272715765172; http://lattes.cnpq.br/2346858488495749; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    During the last decade, it has been observed the rapid development of antimicrobial resistance among clinical isolates of Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., and Acinetobacter spp. worldwide. The production of ?-lactamases is the most important mechanism of resistance in Gram-negative bacilli, being the carbapenemases the most versatile mechanisms of carbapenem resistance. These enzymes have broad spectrum of activity, making difficult the selection of adequate antimicrobial therapy. Furthermore, genes encoding ?-lactamases are highly transmissible. Objective: This study aimed to evaluate the performance of five phenotypic methods for detection of carbapenemase-producing Gram-negative bacilli. Methods: Strains previously characterized were pulled out from the LEMC/ALERTA bank of microorganisms. The confirmation of carbapenemase production was performed by ertapenem hydrolysis using MALDI-TOF MS. The phenotypic tests evaluated were: Hodge modified test, ANVISA Technical Note 01/2013, Carba NP and its modification, CarbAcineto NP, Blue-Carba, CarbapenemBac, and CarbapenemBac Metallo. Results: Although the specificity rates of the ANVISA Technical Note and MHT were 100%, the Technical Note (97.3%) showed higher sensitivity rate than that of the MHT (88.5%) for carbapenemase detection. The Carba NP, Blue-Carba and CarbapenemBac tests showed high sensitivity and specificity rates (100%) when colonies subcultured on Mueller-Hinton agar were tested. The sensitivity and specificity rates of Carba NP (98.6 and 100%), BlueCarba (97.1 and 91%) and CarbapenemBac (96.5 and 100%) were slightly lower when bacterial colonies were obtained from blood agar. On the other hand, the sensitivity rates of Carba NP (71.1%) and Blue-carba (68.9%) were unacceptable when colonies obtained from MacConkey agar were evaluated. However, the sensitivity of CarbapenemBac (97.3% sensitivity) was less affected by the MacConkey agar. Conclusions: We conclude that 1. The colorimetric methods showed excellent sensitivity and specificity for carbapenemases detection when bacterial colonies were subcultured on Mueller-Hinton agar or blood agar; 2. Bacteria colonies subcultured on MacConkey agar must not be utilized for colorimetric tests, except for CarbapenemBac, which showed a good sensitivity and specificity rates for detection of carbapenemases independently of the culture medium used to subculture the bacterial isolate.
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    Caracterização de plasmídeos de isolados clínicos de acinetobacter spp. produtores de carbapenemases
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-12-05) Silva, Adriana Pereira de Matos Marques [UNIFESP]; Gales, Ana Cristina [UNIFESP]; Silva, Rodrigo Cayô da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5699739668358897; http://lattes.cnpq.br/8402272715765172; http://lattes.cnpq.br/1117846722738557; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    ABSTRACT Acinetobacter spp. is a nosocomial pathogen frequently isolated in ICU patients. High resistance rates have been detected among Acinetobacter spp.. Carbapenem Hydrolyzing Class D β-lactamases (CHDL) production is the most frequent and the most important resistance mechanism. This species is able to acquire plasmids and mobile genetic elements (MGEs) that mobilize resistance genes. This study aimed to describe plasmids of carbapenemase producing Acinetobacter spp. clinical isolates. Six carbapenem resistant Acinetobacter spp. strains were selected as OXA-58, OXA-143, OXA-231 and OXA-253 producing. Strain identification was performed on MALDI-TOF MS and confirmed by rpoB sequencing. Carbapenemase detection was confirmed by PCR and susceptibility testing was performed by broth microdilution. MLST was performed to evaluate the ancestrality. The pool of plasmids was extracted using Mini Prep Extraction Kit® and quantified in Qubit® 3.0. Libraries were constructed using Illumina® TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit – SetA generating ~550 bp and sequencing was performed in Illumina® MiSeq 2x300 bp in paired-end mode. Sequences were assembled using softwares Newbler 3.0 and Ray 2.3.1. Automatic annotation was performed using SABIA/LNCC platform and manual validation was performed using NCBI Blast, UniProt, ISFinder e ResFinder 2.1 softwares. The illustration of the circularized plasmids and in silico analysis of replicase gene group (AbGR) was obtained of Snap Gene® program. Promoter sequences were suggested by BPROM tool. Five of six strains were identified as A. baumanni and one was identified as A. seifertii. High MIC rates were observed to the β-lactams tested. Only polymyxin B and minocyclin presented good activity to the tested strains, except A. seifertii that showed resistance to polymyxin B (MIC: 4μg/mL). OXA-231 producing strain was included on ST107, OXA-253 on ST25 and OXA-58 producing A. seifertii and A. baumannii were included on ST551 and ST15, respectively. A total of 23 plasmids were obtained from the six analyzed strains. Of strain A-58.015 plasmids pAb58015_a (118.738 bp/173 ORFs; blaOXA-143 carrying), pAb58015_b (55.356 bp/62 ORFs), pAb58015_c (6.520 bp/9 ORFs) and pAb58015_d (2.368 bp/3 ORFs) were obtained; on strain 81048, three identic plasmids pAb58015_b, pAb58015_c and pAb58015_d were observed and also plasmids pAb81048_a (113.646 bp/177 ORFs), pAb81048_b (87.915 bp/101 ORFs), pAb81048_c (13.910 bp/21 ORFs), pAb81048_d (9.304 bp/15 ORFs), pAb81048_e (7.763 bp/6 ORFs; blaOXA-143 carrying), pAb81048_f (5.300 bp/6 ORFs) and pAb81048_g (2.845 bp/5 ORFs) were obtained; on strain A-41.652, plasmids pAb41652_a (101.946 bp/137 ORFs), pAb41652_b (11.844 bp/12 ORFs) and pAb41652_c (3.955 bp/3 ORFs; blaOXA-231 carrying) were observed; on strain 86, plasmids pAb86_a (234.383 bp/256 ORFs) and pAb86_b (13.453 bp/14 ORFs; blaOXA-253 carrying) were sequenced; on strain 1069, plasmids pAs1069_a (24.672 bp/44 ORFs; blaOXA-58 carrying) and pAs1069_b (13.129 bp/14 ORFs); and from strain A-45.063, plasmids pAb45063_a (183.767 bp/209 ORFs) and pAb45063_b (19.808 bp/24 ORFs; blaOXA-58 carrying) were verified. Plasmids were classified in six different AbGR groups (GR2, GR3, GR4, GR6, GR8 and GR19). Resistance genes of distinct antimicrobial classes were found in approximately half of the sequenced plasmids. Nine plasmids had two or three virulence genes. A new genetic environment in OXA-143 and variants OXA-231 and OXA-253 was described in our isolates. The presence of an ISAba825 upstream blaOXA-58 in A. seifertii was the main difference on the genetic environment of blaOXA-58 inserted in plasmid pAb45063_b in A. baumannii. The number of MGEs found in plasmids evaluated in this study suggests a high mobilization capacity of those structures and consequently horizontal transfer of resistance.
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    Caracterização molecular de isolados pertencentes ao complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii obtidos de amostras clínicas e ambientais
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-05-27) Alves, Rebeca Lobato [UNIFESP]; Minarini, Luciene Andrade da Rocha [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5226657617185982; http://lattes.cnpq.br/2680532753717514
    Este estudo teve como objetivo caracterizar molecularmente isolados de Acinetobacter spp. obtidos de amostras clínicas de pacientes atendidos no Hospital Municipal e em Serviços de Saúde na comunidade de Diadema, no período de maio a dezembro de 2019, e de importantes reservatórios de água da Região Metropolitana de São Paulo em 2021. A identificação dos isolados clínicos e ambientais foi realizada por MALDI-TOF MS e a concentração inibitória mínima para os principais antimicrobianos foi determinada por diluição em ágar. Os genes que codificam mecanismos de resistência aos β-lactâmicos, incluindo carbapenêmicos, determinantes plasmidiais de resistência à colistina e às quinolonas foram investigados por PCR. A análise de similaridade genética foi realizada por REP-PCR. Ao todo, 53 isolados clínicos pertencentes ao complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii foram incluídos no estudo, sendo 52 A. baumannii e um A. pittii. Foi observado 86,79% e 22,65% de isolados resistente ao imipenem e à colistina, respectivamente. A maior parte dos isolados clínicos (41, 83,68%) foi obtida de pacientes internados no Hospital Municipal, causando principalmente infecções no trato respiratório inferior (14, 26,42%). Os genes encontrados foram blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, em 32 (60,37%) e 16 (30,18%) isolados, respectivamente. O gene blaOXA-51-like foi detectado em todos os isolados identificados como A. baumannii. Além disso, foram evidenciados 20 grupos clonais nos isolados clínicos do complexo. Nas amostras de água, 25 isolados de Acinetobacter spp. foram recuperados, sendo sete A. calcoaceticus, dois A. pittii, um A. baumannii e 15 A. baylyi. Os isolados de água foram provenientes de um único ponto de coleta da Represa Billings. Ao todo, 14 isolados de A. baylyi apresentaram o gene blaOXA-24/40-like, dos quais 12 demonstraram resistência ao imipenem. Além disso, cinco isolados de A. baylyi apresentaram genes de resistência às quinolonas, sendo o gene qnrA o mais frequente. Os resultados obtidos nesse estudo reforçam a necessidade de manter constante vigilância e o monitoramento dos isolados de Acinetobacter spp.
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    Caracterização molecular e bioquímica de variantes de Oxa-50 em isolados de Pseudomonas aeruginosa
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-04-10) Oliveira, Ana Paula Streling de [UNIFESP]; Gales, Ana Cristina [UNIFESP]; Silva, Rodrigo Cayô da [UNIFESP]; Machado, Marcelo Ferreira Marcondes [UNIFESP]; Rodrigo Cayô da Silva : http://lattes.cnpq.br/5699739668358897; Marcelo Ferreira Marcondes Machado : http://lattes.cnpq.br/9703373400186586; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    RESUMO As enzimas do tipo OXA-50 representam um grupo de oxacilinases cromossômicas intrínsecas de Pseudomonas aeruginosa. No presente estudo, caracterizamos as propriedades bioquímicas e moleculares de três variantes de OXA-50 isoladas de P. aeruginosa. Foram selecionadas três cepas, sendo estas: Pb9 (blaOXA-488) - cepa clínica apresentando um fenótipo raro e emergente de resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro (ESCph); P-1088 (blaOXA-494) - primeiro isolado produtor de SPM-1; e PA01 cepa carreadora do gene blaOXA-50 original utilizada também como controle nos ensaios de qRT-PCR. O contexto genético do blaOXA-50-like da Pb9 e P-1088 foram sequenciados e comparados com a PA01. Os fragmentos gerados pela reação de PCR do gene blaOXA-50-like foram clonados no vetor pET-26b+ e os plasmídeos recombinantes foram expressos em cepas de Escherichia coli BL21 (placas de LB ágar + 50 μg/mL de canamicina). As CIMs para os clones transformantes foram determinados por Etest®. A produção da OXA-50 e de suas variantes foram induzidas em 1 L de caldo LB suplementado com 0.25 mM de IPTG e incubados durante a noite à 20°C. As β- lactamases foram liberadas do espaço periplasmático por choque osmótico e purificadas por cromatografia de exclusão molecular e troca iônica. Para a triagem inicial da hidrólise das enzimas frente aos β-lactâmicos foi realizada a cromatografia de alta eficiência (HPLC) para 10 diferentes antimicrobianos usando uma coluna C18 de 1 mL através de um gradiente linear de acetonitrila. Os ensaios cinéticos foram realizados apenas para os antimicrobianos que apresentaram hidrólise positiva no HPLC. Os níveis transcricionais dos genes mexB, mexD, mexF and mexY, ampC, poxA, poxB e oprD foram avaliados pela técnica de qRT-PCR. A OXA-488 e a OXA-494 diferem da OXA-50 em três (Gly14Ala, Thr16Ala, Arg49Leu) e dois aminoácidos (Asp109Glu and Arg167His), respectivamente. Todos os genes blaOXA-50-like avaliados eram flanqueados a montante pelo gene poxA e a jusante por uma ORF que codifica uma proteína hipotética de 407 bp. A falta de uma região promotora na região intergênica, e a presença de uma região ρ-terminadora a montante do gene blaOXA-50-like, indicam que estes genes formam um operon (poxAB). Mutações no gene poxA foram encontrados nas cepas P1088 (Phe7Ser, Ala50Thr and Thr232IIe) e Pb9 (Phe7Ser and Asp279Ala). A análise realizada por HPLC demonstrou que todas as variantes de OXA-50 foram capazes de hidrolisar benzilpenicilina, ampicilina, oxacilina, ticarcilina e imipenem. No entanto, as CIMs para benzilpenicilina e carbapenêmicos não demonstraram diferenças quando comparadas à cepa selvagem BL21 para os clones transformantes. Em concordância com os dados do HPLC, os ensaios cinéticos demonstraram boa eficiência catalítica das enzimas testadas frente à benzilpenicilina e à oxacilina. Entretanto, todas as variantes de OXA-50 avaliadas não hidrolisam ticarcilina eficientemente. Entre as variantes avaliadas, a OXA-488 demonstrou melhor atividade catalítica frente ao imipenem. Os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM estavam hiperexpressos nas cepas Pb9 (3,06 vezes) e P1088 (16,48 vezes), respetivamente. Embora aexpressão dos genes blaOXA-488 e blaOXA-494 estivesse aumentado de ~4x e ~3x em relação ao gene blaOXA-50, seus respectivos genes poxA tiveram a expressão aumentada em apenas 1,18 e 1,13 vezes. Nossos resultados demostraram que a OXA-50 e suas variantes podem hidrolisar imipenem, mas não meropenem, ticarcilina e ESCph. Além disso, as baixas CIMs para os carbapenêmicos verificadas entre os clones transformantes podem ser devido ao hospedeiro utilizado no ensaio de transformação.