Navegando por Palavras-chave "Gomesina"

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    Estudos de síntese, conformação e atividade biológica da gomesina e análogos através de diferentes metodologias
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2013) Domingues, Tatiana Moreira [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9178927522709552; http://lattes.cnpq.br/1357848049935882; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O peptideo antimicrobiano gomesina (Gm) foi inicialmente isolado da hemolinfa da Acanthoscurria gomesiana, uma aranha caranguejeira encontrada no Brasil. Fortemente cationico, possui 18 residuos de aminoacidos (pGlu1-Cys-Arg-Arg-Leu5-Cys-Tyr-Lys-Gln-Arg10-Cys-Val-Thr-Tyr-Cys15-Arg-Gly-Arg-NH2) e duas ligacoes de dissulfeto nas posicoes Cys2,15 e Cys6,11. Trata-se de um PAM de largo espectro de acao, cuja atividade litica foi avaliada como elevada e rapida. Gm e analogos foram sintetizados pelo metodo em fase solida e utilizando-se a estrategia t-Boc. Em seguida, os peptideos foram clivados, purificados e caracterizados, alcancando-se um indice de pureza satisfatorio. Por meio de ensaios biologicos (de atividade antimicrobiana e hemolitica), estudos espectroscopicos e de cinetica de vazamento de carboxifluoresceina (CF), a Gm e todos os seus analogos foram avaliados, tendo sido possivel tracar uma relacao estrutura/atividade para esses peptideos, que comprova a importancia da manutencao das ligacoes de dissulfeto pelos analogos da Gm para o desempenho de uma boa atividade litica. Com base nesses primeiros resultados, a Gm e seu analogo menos ativo ([Ser2,6,11,15]-Gm) foram selecionados para analises mais detalhadas, utilizando-se, para tanto, modelos de membrana. Assim sendo, bicamadas lipidicas (LUVs), micelas e monomeros de SDS (dodecil sulfato de sodio) foram os sistemas mimeticos escolhidos para investigar o mecanismo de acao desses peptideos. A analise dos dados de calorimetria de titulacao isotermica (ITC) e de cinetica de vazamento de CF indicou forte interacao da Gm com as LUVs e rapida acao de desestruturacao dessas bicamadas, em um processo entalpicamente dirigido. Atraves da utilizacao das tecnicas de espalhamento de luz estatico e dinamico, e microscopia otica de contraste de fase, foi possivel detectar a formacao de grandes agregados lipidicos, mesmo em baixas razoes peptideo/lipidio. Com o intuito de minimizar a agregacao lipidica, um lipidio modificado contendo o polimero polietilenoglicol (PE-PEG2000) foi adicionado as vesiculas. A Gm tambem apresentou intensa ligacao exotermica (ITC) e uma alta taxa de permeabilizacao dessas bicamadas modificadas, alem de reduzida formacao de agregados. O analogo [Ser2,6,11,15]-Gm exibiu semelhante atividade a da Gm em interacao com LUVs contendo 50 mol% de POPG e uma diminuicao acentuada dessa atividade para LUVs com 25 mol% de POPG, reafirmando a importancia da atracao eletrostatica para esses peptideos. Alem disso, espectros de CD confirmaram que a Gm e seu analogo linear adotam conformacao em dobra beta quando em contato com lipossomas e SDS acima e abaixo da CMC (concentracao micelar critica). Em outros estudos, analises de fluorescencia e absorbancia de analogos ciclicos da Gm, marcados com um residuo de Trp, em presenca de diferentes concentracoes de SDS, apontaram para uma maior interacao desses peptideos com o SDS monomerico, resultando em um maior blueshift do espectro de emissao do Trp, bem como em um aumento na absorbancia das amostras, maior ou igual ao causado pelo SDS na forma micelar. O uso de dois sistemas mimeticos de membrana diferentes, bem como as diversas metodologias empregadas, foi fundamental para uma ampla investigacao das etapas requeridas pela Gm para causar a ruptura das biomembranas. Alem disso, esses estudos foram importantes na deteccao e caracterizacao da formacao de agregados durante a interacao da Gm com moleculas anfifilicas anionicas, agregacao essa que possivelmente se estende a outros peptideos cationicos, e que muitas vezes e negligenciada.
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    Síntese, estudos conformacionais e atividade biológica de novos análogos do peptídeo antimicrobiano gomesina
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-08-31) Mendes, Roberta Brandao [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1357848049935882; http://lattes.cnpq.br/9759007573287366; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Gomesin (ZCRRLCYKQRCVTYCRGR-NH2) is an antimicrobial peptide isolated from hemocytes of the Brazilian spider Acanfhoscurria gomesiana. The molecule has four cysteines that form two intramolecular disulfide bridges at positions 2.15 and 6.11. Gm has a broad spectrum of action and a high toxicity against human erythrocytes. This study aimed to the synthesis of new analogues of gomesin to evaluate their structure-activity and their mechanisms of action in comparison to Gm. Thus, linear and cyclic analogs were synthesized, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15, Ac-Ifrp", D-Lys8]-Gm2-15, Ac- [Thr2,6,11,15]-Gm2_1A5c, -[ Thr2,6,11,15,D-Lys8]-Gm2_1a5nd Ac-[Thr2,6,11,15,D-Pro9]-Gm2_1b5y using the solid phase peptides synthesis in a t-Boc strategy. Then peptides were cleaved, purified and characterized. Antimicrobial activity were evaluated against C. albicans, B. megaferium, P. aeruginosa, P. expansum, C. neoformans, A. niger, Cladosporium sp and S. cerevisiae; hemolytic activity was determined against human erythrocytes; Peptides degradation resistance in human plasma and antitumoral activity against K562 cells were also evaluated. Structural analysis by Circular Dichroism spectroscopy and peptide/vesicle interaction using giant unilamellar vesicles and optical microscopy were also performed. Thermodynamical studies of the interaction peptide I lipid using large unilamellar vesicles (LUVs) was done by isothermal titration calorimetry (ITC). Our results showed that analogues, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15 and Ac-IIrp", D-Lys8]-Gm2-15, presented the best antimicrobial activity, particularly against microorganisms A. nigerand S. cerevisiae, their performance were even better than Gm. Ali showed low hemolytic activity even at 100 IJM concentration. They were quite resistant to degradation. Fro the Circular Dichroism studies, we observed that the cyclic compounds showed conformations similar than to gomesin, they also assume a p-hairpin conformation. On the other hand, linear analogues showed a prevalence of random conformation. The Iytic mechanism of action of Gm and Ac-Gm2-15 showed to be very similar, both of them caused a disruption of the membrane. Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_1p5resented a pore formation mechanism. From our results, we had confirmed the crucial importance of the disulfide bridges in the Iytic mechanism of action; in fact its removal causes a decrease in the antimicrobial, hemolytic and antitumor activities. The disulfide bridges also have a great contribution to the stability and strength the action against plasma protease. Gomesin fragments should have less potency, maybe due to the lower amount of charge and also because of the removal of amino acids in the N- and C-terminal portions
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    Acesso aberto (Open Access)
    Síntese, estudos conformacionais e do mecanismo de ação da gomesina
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-01-27) Domingues, Tatiana Moreira [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A gomesina (Gm) é um potente peptídeo antimicrobiano catiônico. Este peptídeo e seu análogo linear [Ser2,6,11,15]-Gm, com menor atividade lítica, foram sintetizados pela metodologia da fase sólida, empregando-se a estratégia t-Boc. Neste estudo, investigamos a interação da Gm e da [Ser2,6,11,15]-Gm com vesículas unilamelares gigantes (GUVs), compostas por membranas lipídicas de POPC ou POPC/POPG, através de microscopias óticas de contraste de fase e fluorescência. As análises se dividiram em duas diferentes partes. Na primeira, observou-se o efeito da injeção de uma solução peptídica, com micropipeta, na vizinhança das GUVs. Como resultado da interação peptídeo/lipídio, as GUVs foram desestabilizadas e romperam-se rapidamente, sem observação de formação de poros estáveis durante todo o experimento. Nos estudos controles, em ausência de peptídeo, as GUVs não romperam de forma espontânea. Peptídeos marcados com a sonda fluorescente rodamina (Rh) foram injetados e mostram que a Gm primeiramente acumula-se na superfície da vesícula, na qual, então, pequenas partículas de alto-contraste são formadas e ocorre, eventualmente, a destruição das GUVs. Este fato leva-nos a especular que a Gm rompe as membranas via modo carpete. Na segunda parte, uma solução contendo GUVs foi misturada a crescentes concentrações peptídicas para quantificação da ação lítica destes peptídeos em vesículas de diferentes composições lipídicas. O efeito de atividade lítica observado foi maior que 90% em baixas concentrações tanto de Gm quanto de [Ser2,6,11,15]-Gm em GUVs compostas de POPC, lipídio eletricamente neutro, e de uma mistura de POPG, negativamente carregados, a POPC em diferentes proporções. Estudos conformacionais foram feitos por duas técnicas espectroscópicas distintas: dicroísmo circular (CD) e fluorescência. A Gm e seu análogo linear aparentemente interagiram com as cargas negativas de SDS nas concentrações acima e abaixo da CMC. Os espectros de CD da [Ser2,6,11,15]-Gm em água apresentaram uma banda fortemente negativa em 198 nm, indicando tratar-se de uma estrutura desordenada, como esperado para peptídeos livres em solução, e não de uma dobra beta como apresentada pela Gm. A partir dos resultados obtidos, foi possível concluir que ambos os peptídeos analisados interagem com vesículas compostas por fosfolipídios e induzem o vazamento de seu conteúdo interno dependentemente da carga de membrana destas, o que corrobora estudos prévios que sugerem que as interações eletrostáticas com a bicamada lipídica dos micro-organismos representam um importante papel no mecanismo de ação da Gm.