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    Restrito
    Análise da N-glicosilação aberrante de TIMP-1 e seu papel na progressão do melanoma
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-01-17) Justo, Beatriz Laís [UNIFESP]; Jasiulionis, Miriam Galvonas [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3057188718614807; https://lattes.cnpq.br/9283411974338596
    Diversos estudos mostram que o Inibidor Tecidual de Metaloprotease 1, TIMP-1, tem sua expressão aumentada em diferentes tipos de tumores e que este aumento está correlacionado com um pior prognóstico. Hoje, sabe-se que TIMP-1 apresenta funções pleiotrópicas que vão desde a inibição de Metaloproteases de Matriz (MMPs) até a ativação de diferentes vias de transdução de sinais através de sua ligação com seus receptores de membrana, CD63 e β1- integrina. Trabalhos anteriores do nosso grupo também demonstraram haver aumento da expressão de TIMP-1, formação do complexo supramolecular TIMP1 / CD63 / β1-Integrina e ativação de vias de sinalização intracelular ao longo da progressão do melanoma. Recentemente, um estudo utilizando células de câncer de cólon demonstrou que TIMP-1 apresenta ramificações do tipo β1,6-N-acetilglucosamina, uma N-glicosilação do tipo aberrante catalisada pela enzima MGAT5, e ainda, a presença desta N-glicosilação aberrante em TIMP 1 foi diretamente correlacionada com sua função de induzir vias de sinalização intracelulares que modulam o comportamento celular. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre o estado de glicosilação de TIMP-1, inclusive em melanomas. Por esse motivo, este trabalho teve como objetivo analisar a presença de N-glicosilação aberrante em TIMP-1 e entender como essa N glicosilação aberrante interfere nos papéis que TIMP-1 exerce, tanto na inibição de MMPs quanto na sua capacidade de se ligar aos seus receptores CD63 e β1-Integrina para ativar vias de sinalização envolvidas em sobrevivência e resistência à morte celular, em linhagens celulares de modelo de progressão do melanoma. Através de ensaios de pooldown com L-PHA, lectina que reconhece tal padrão aberrante de N-glicosilação, demonstramos que TIMP-1, CD63 e β1-Integrinas são alvos da enzima MGAT5 em células de melanoma, principalmente metastáticas. Além disso, um plasmídeo contendo a sequência gênica de TIMP-1 com mutações pontuais em seus dois sítios de N-glicosilação foi desenvolvido para induzir a expressão de TIMP-1 aglicosilado. Este plasmídeo será utilizado em ensaios que visam entender como esse padrão aberrante de N-glicosilação interfere nos papéis que TIMP-1 exerce na progressão do melanoma.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Timp1 interacts with beta-1 integrin and CD63 along melanoma genesis and confers anoikis resistance by activating PI3-K signaling pathway independently of Akt phosphorylation
    (Biomed Central Ltd, 2013-03-25) Toricelli, Mariana [UNIFESP]; Melo, Fabiana H. M. [UNIFESP]; Peres, Giovani B. [UNIFESP]; Silva, Debora C. P.; Jasiulionis, Miriam G. [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Ludwig Inst Canc Res
    Background: Anoikis resistance is one of the abilities acquired along tumor progression. This characteristic is associated with metastasis development, since tumorigenic cells must survive independently of cell-matrix interactions in this process. in our laboratory, it was developed a murine melanocyte malignant transformation model associated with a sustained stressful condition. After subjecting melan-a melanocytes to 1, 2, 3 and 4 cycles of anchorage impediment, anoikis resistant cells were established and named 1C, 2C, 3C and 4C, respectively. These cells showed altered morphology and PMA independent cell growth, but were not tumorigenic, corresponding to pre-malignant cells. After limiting dilution of 4C pre-malignant cells, melanoma cell lines with different characteristics were obtained. Previous data from our group showed that increased Timp1 expression correlated with anoikis-resistant phenotype. Timp1 was shown to confer anchorage-independent growth capability to melan-a melanocytes and render melanoma cells more aggressive when injected into mice. However, the mechanisms involved in anoikis regulation by Timp1 in tumorigenic cells are not clear yet.Methods: the beta 1-integrin and Timp1 expression were evaluated by Western blotting and CD63 protein expression by flow cytometry using specific antibodies. To analyze the interaction among Timp1, CD63 and beta 1-integrin, immunoprecipitation assays were performed, anoikis resistance capability was evaluated in the presence or not of the PI3-K inhibitors, Wortmannin and LY294002. Relative expression of TIMP1 and CD63 in human metastatic melanoma cells was analyzed by real time PCR.Results: Differential association among Timp1, CD63 and beta 1-integrins was observed in melan-a melanocytes, 4C pre-malignant melanocytes and 4C11- and 4C11+ melanoma cells. Timp1 present in conditioned medium of melanoma cells rendered melan-a melanocytes anoikis-resistant through PI3-K signaling pathway independently of Akt activation. in human melanoma cell lines, in which TIMP1 and beta-1 integrin were also found to be interacting, TIMP1 and CD63 levels together was shown to correlate significantly with colony formation capacity.Conclusions: Our results show that Timp1 is assembled in a supramolecular complex containing CD63 and beta 1-integrins along melanoma genesis and confers anoikis resistance by activating PI3-K signaling pathway, independently of Akt phosphorylation. in addition, our data point TIMP1, mainly together with CD63, as a potential biomarker of melanoma.