Navegando por Palavras-chave "Barreira hematoencefálica"
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Angioedema Hereditário: desenvolvimento de um método de diagnóstico molecular baseado no gene SERPING1 e de um modelo celular in vitro da barreira hematoencefálica(Universidade Federal de São Paulo, 2022-12-19) Amorim, Priscila Nicolicht de [UNIFESP]; Porcionatto, Marimélia Aparecida [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESp]; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/6155537170968904; http://lattes.cnpq.br/2045104800186586Introdução: O angioedema hereditário é uma doença genética decorrente de variantes patogênicas no gene SERPING1, que codifica o inibidor de C1 esterase, cuja prevalência mundial estimada é de 1:50.000 a 1:100.000. A deficiência do inibidor de C1 esterase causa exacerbação das cascatas do complemento, fibrinolítica, da coagulação e das calicreínas-cininas e aumento da produção de mediadores inflamatórios, principalmente bradicinina, pela ação da enzima calicreína plasmática. O aumento de bradicinina ocasiona vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular levando ao extravasamento de fluído dos vasos para os tecidos, causando edema. O angioedema hereditário é caracterizado clinicamente por episódios recorrentes de edema local ou generalizado, além de oferecer risco de morte por asfixia. Apesar da generalização da ocorrência de edema, o sistema nervoso central parece ser um local protegido, pois os episódios de edema cerebral são raros ou inexistentes no angioedema hereditário. Com base nesse fenômeno, nossa hipótese é que as células endoteliais da microvasculatura cerebral expressem um inibidor da calicreína plasmática, impedindo a geração de bradicinina no local. Objetivos: Os objetivos desta tese foram i) desenvolver um método para detectar grandes deleções e inserções no gene SERPING1 para o diagnóstico de angioedema hereditário e, ii) estabelecer um protocolo simplificado com alto rendimento celular para o isolamento e purificação de células endoteliais da microvasculatura cerebral de camundongo neonato. Métodos: i) A Técnica de Quantificação de Éxons (TQE) foi desenvolvida utilizando o DNA total extraído de sangue de pacientes de duas famílias brasileiras com histórico clínico de angioedema hereditário, baixos níveis plasmáticos de C4 e C1-INH e nenhuma alteração patogênica em SERPING1 analisada por sequenciamento de Sanger; ii) Descrevemos um protocolo simplificado usando camundongos recém-nascidos C57BL/6 no dia pós-natal (P1) para isolar, purificar e cultivar monocamadas de células endoteliais da microvasculatura cerebral em dois substratos diferentes (lamínulas e insertos). Resultados: i) O uso da TQE permitiu detectar duas grandes deleções diferentes no éxon 4, uma de 1356 pb e outra de 1804 pb, que resultaram da recombinação de dois elementos Alu presentes nos íntrons 3 e 4 do gene SERPING1, ii) Testamos a função de células endoteliais da microvasculatura cerebral usando um modelo de privação de oxigênio-glicose. A caracterização e validação in vitro da cultura primária das células endoteliais incluiu microscopia de luz, imunomarcação e análise do perfil de expressão gênica. A medida da resistência elétrica transendotelial (TEER) foi usada como um ensaio funcional dos complexos de junção aderente. Conclusão: Com o desenvolvimento e utilização da técnica de quantificação de éxons foi possível estabelecer o diagnóstico molecular de duas famílias afetadas com o angioedema hereditário. Além disso, estabelecemos um modelo in vitro da barreira hematoencefálica que poderá ser utilizado para testar a hipótese da existência de um possível inibidor da calicreína plasmática expresso localmente nas células endoteliais da microvasculatura cerebral. A caracterização desse inibidor poderá ser um passo importante para o conhecimento e desenvolvimento de novas terapias para o tratamento do angioedema hereditário, para doenças neurológicas e neurodegenerativas.
- ItemSomente MetadadadosAvaliação da barreira hemato-encefálica na doença do enxerto contra hospedeiro crônica(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1997) Almeida, Sergio Monteiro de [UNIFESP]; Ferreira, Euripedes [UNIFESP]
- ItemAcesso aberto (Open Access)Modelagem in vitro da doença de Alzheimer esporádica associada à hiperglicemia(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-13) Rossi, Maria Fernanda Kobayashi [UNIFESP]; Porcionatto, Marimelia Aparecida [UNIFESP]; Salles, Geisa Rodrigues [UNIFESP]; Ferreira, Paula Scanavez [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8234187349017355; http://lattes.cnpq.br/1206986066752499; http://lattes.cnpq.br/6155537170968904; http://lattes.cnpq.br/3369430764012031O aumento da expectativa de vida nas últimas décadas, ao mesmo tempo em que reflete medidas positivas de saúde pública, também impões novos desafios para a sociedade no século XXI. Assim, doenças crônicas e degenerativas, como diabetes mellitus (DM) e a doença de Alzheimer (DA) se destacam pelos impactos negativos que poderão causar no sistema de saúde. Além do impacto individual de cada uma dessas doenças, estudos epidemiológicos e experimentais apontam para a DM como um fator de risco para o desenvolvimento da DA. Uma vez que a DA esporádica, é a mais prevalente e apresenta uma causa multifatorial, ainda há muito a se descobrir a respeito de sua origem, desenvolvimento, progressão e impacto em outros tipos celulares, além dos neurônios. Nesse contexto, a ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) tem sido apontada como um possível fator prévio ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, inclusive a DA. Embora os modelos animais tenham gerado grandes avanços na compreensão de doenças complexas, a relação de causa e consequência entre DM e DA ainda não é clara e este projeto objetivou desenvolver um sistema in vitro que permita investigar os efeitos da presença de alta concentração de glicose nas células endoteliais e permeabilidade da barreira, bem como o seu impacto no microambiente neuronal na presença de oligômeros Aβ (AβOs). Para isso, utilizamos células exclusivamente humanas: SH-SY5Y (linhagem celular de neuroblastoma humano) como modelo neuronal, células endoteliais e astrócitos derivados de células pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) para simular a BHE em dispositivos de transwell. Nossos resultados indicam que o modelo desenvolvido durante a execução deste projeto poderá ser utilizado para estudos celulares e moleculares da potencial relação entre DM e DA.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Modelo in vitro da barreira hematoencefálica para investigação da ação dos produtos finais de glicação avançada relacionados à diabetes mellitus no risco da doença de Alzheimer(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-13) Story, Amanda Martins [UNIFESP]; Porcionatto, Marimélia Aparecida [UNIFESP]; Salles, Geisa Rodrigues [UNIFESP]; Ferreira, Paula Scanavez [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8234187349017355 [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1206986066752499; http://lattes.cnpq.br/6155537170968904; http://lattes.cnpq.br/9788542342938022A diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica cada vez mais associada a danos cognitivos e demência, aumentando o risco de neuropatias, especialmente a doença de Alzheimer (DA). Um dos efeitos da hiperglicemia é o acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs), cujas ações têm se destacado como um forte elo entre as doenças. Para compreender os mecanismos associados e desencadeados pelos AGEs, torna-se necessário desenvolver modelos in vitro que capturem a complexidade da composição e do funcionamento da BHE. Com isso, objetivamos desenvolver um modelo celular da BHE onde pudéssemos mimetizar uma condição hiperglicêmica semelhante à da DM para investigarmos a ação dos AGEs nessa estrutura, com foco nos neurônios. O modelo foi organizado no sistema transwell em tri-cultura com células endoteliais e astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC-EC e hiPSC-AST), organizados na porção apical e basolateral do inserto, respectivamente, e neurônios derivados da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, presentes no fundo do poço da placa. Monoculturas em 2D das hiPSC-EC e células SH-SY5Y receberam diferentes contrações de soroalbumina bovina ligada a produtos finais de glicação avançada (AGE-BSA) e em concentrações normal e de alta de glicose. Como resultado, as SH-SY5Y não diferenciadas apresentaram maior estresse oxidativo e menores índices de morte celular em comparação com as diferenciadas. As hiPSC-EC apresentaram redução na viabilidade quando cultivadas na presença de AGE-BSA 100 µg/mL. Assim, essa concentração foi utilizada no tratamento das células cultivadas em transwell por 48 h. A análise da integridade da BHE, através da medida de resistência elétrica transendotelial (TEER) e permeabilidade ao FITC-Dextran, mostraram que não houve danos significativos à BHE. Já a análise qualitativa da imunofluorescência dos neurônios sugeriu um aumento nos níveis de proteína precursora amilóide (APP), receptores de AGEs (RAGE) e oligômeros de beta-amilóide (AβO), além de alterações morfológicas. Apesar dos nossos dados anteriores mostrarem que não houve mudanças significativas na permeabilidade da BHE, houve uma comunicação entre as células e os neurônios responderam com alterações metabólicas que podem estar presentes na patogênese da DA.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Relação P2/P1 e morfologia de onda da pressão intracraniana são alteradas na hipertensão renovascular(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018) Silva, Marcos Vinicius Fernandes [UNIFESP]; Colombari, Eduardo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4544450092427426; http://lattes.cnpq.br/6973089949225704; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)O papel da hipertensão renovascular ainda não está totalmente esclarecido na manutenção da pressão intracraniana (PIC), sobretudo no modelo experimental de hipertensão de Goldblatt, 2 rins e 1 clipe (2R1C), caracterizado por disfunção autonômica e hiperatividade do sistema renina-angiotensina (SRA). Ainda, o monitoramento e o acompanhamento temporal da dinâmica da PIC (incluindo sua morfologia de onda e relação P2/P1) tornam-se essenciais na hipertensão arterial, visto que na clínica o monitoramento da PIC é realizado comumente em situações de emergência, como acidente vascular cerebral e hidrocefalia. Portanto, nosso objetivo foi analisar os efeitos da hipertensão renovascular ao longo do tempo na PIC em ratos. A hipertensão foi induzida pela clipagem da artéria renal e o monitoramento da PIC foi realizado nos animais em diferentes semanas após a indução da hipertensão. Quatro semanas após a cirurgia, os animais 2R1C apresentaram um aumento significante da PIC quando comparado aos animais controle (16 ± 0,11 vs. 8,05 ± 0,9 mmHg, respectivamente). Adicionalmente ao aumento da PIC, houve aumento significante da relação P2/P1 nos animais hipertensos (1,07 ± 0,012 vs. 0,86 ± 0,021 animais controle; respectivamente) e alteração da morfologia de onda da PIC, sugerindo comprometimento na complacência cerebral de ratos 2R1C. Encontramos, também, ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) nas regiões do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), da região rostroventrolateral (RVL) e núcleo do trato solitário (NTS) três semanas após a cirurgia 2R1C. Em relação às respostas ao bloqueio dos receptores AT1 de angiotensina II (ANG II), a administração de losartan (i.v.) em ratos 2R1C seis semanas após a cirurgia promoveu redução significante da PIC (14,4 ± 0,8 vs. 18,9 ± 1,23 mmHg tratamento com salina, respectivamente), redução da relação P2/P1 (0,9 ± 0,05 vs. 1,13 ± 0,04 tratamento com salina, respectivamente) e reversão da alteração da morfologia de onda da PIC. Assim, nossos resultados mostram que a hipertensão renovascular promove importantes alterações na dinâmica cerebral ao contribuir na manutenção da pressão intracraniana.