PPG - Farmacologia
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- ItemAvaliação da comunicação cérebro-rim-baço na fisiopatologia da hipertensão arterial renovascular: investigação da influência da inervação renal e esplênica sobre a sensibilidade barorreflexa e neuroinflamação(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-12) Martins, Gustavo dos Reis [UNIFESP]; Bergamaschi, Cassia Marta de Toledo [UNIFESP]; Campos Junior, Ruy Ribeiro de [UNIFESP]; lattes.cnpq.br/2520398649906832; lattes.cnpq.br/1166526138293050; lattes.cnpq.br/3420592081782131Objetivo: Embora compreenda-se a hipertensão arterial sistêmica (HAS) como uma afecção multifatorial, adotando-se múltiplas estratégias terapêuticas no seu tratamento, a relativa alta prevalência de hipertensão resistente sugere a existência de mecanismos ainda não explorados responsáveis pela manutenção da HAS. Estudos apontam para um papel crescente da inervação esplênica e da ativação neuroimune na gênese de diversos modelos de HAS. A corrente tese propõe investigar a influência da denervação renal e esplênica sobre parâmetros cardiovasculares e autonômicos, sobre a neuroinflamação, e sobre o desenvolvimento da hipertensão arterial renovascular. Métodos: Ratos Wistar foram submetidos à denervação renal ou esplênica, seguido por cirurgia para suboclusão da artéria renal esquerda. Após seis semanas, registraram-se parâmetros cardiovasculares e autonômicos basais, e a sensibilidade barorreflexa. Realizou-se, também, uma segunda série independente de experimentos, na qual os ratos foram eutanasiados após as 6 semanas de observação para coleta de sangue e órgãos (baço, rim e encéfalo). Foram realizadas análises histológicas do parênquima esplênico e de núcleos autonômicos centrais (RVLM e PVN), bem como se avaliou o perfil de citocinas em amostras de plasma, baço, rim e encéfalo. Resultados: Animais hipertensos (2R1C) apresentaram elevação dos níveis pressóricos e do drive simpático basal, associado a um déficit na sensibilidade barorreflexa. Animais hipertensos submetidos à denervação renal (2R1C+DNr) ou esplênica (2R1C+DNe) apresentaram melhora nos parâmetros cardiovasculares e a normalização da disfunção autonômica. Ademais, verificou-se, no grupo 2R1C, indicadores de inflamação periférica – hipertrofia de polpa branca esplênica e mobilização plasmática de linfócitos e monócitos – e de neuroinflamação – aumento na população de micróglia na RVLM. Esses parâmetros apresentaram-se reduzidos nos grupos 2R1C+DNr e 2R1C+DNe. Conclusão: A HAS renovascular é uma afecção caracterizada tanto por inflamação sistêmica quanto por neuroinflamação, repercutindo em alterações nos parâmetros cardiovasculares e autonômicos. Os dados aqui descritos apontam para um relevante papel da inervação simpática esplênica na gênese da HAS renovascular.
- ItemImpacto dos piretroides fenpropatrina e cipermetrina na atividade do canal NaV1.5 de humano e o potencial terapêutico da mexiletina e ranolazina(Universidade Federal de São Paulo, 2024-04-05) Alcântara, Fabiana da Silva [UNIFESP]; Campos, Danilo Roman [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8233000987750211; http://lattes.cnpq.br/4869523451913673Introdução: Os piretroides são amplamente utilizados como inseticidas, principalmente em setores agrícolas. No Brasil, a fenpropatrina e a cipermetrina estão entre os piretroides mais comercializados. O mecanismo de ação dessas subtâncias ocorre por meio do seu efeito nos canais de sódio dependentes de voltagem (NaV), alterando a transição do estado aberto para o estado inativo, o que resulta em um aumento da corrente de sódio persistente ou tardia (INa,T). Apesar de ser um mecanismo clássico para os piretroides, não foram encontrados estudos específicos sobre o impacto da fenpropatrina e da cipermetrina sobre a atividade do NaV cardíaco, o Nav1.5h, nem sobre possíveis fármacos capazes de atenuar essas alterações. Objetivos: Investigar os efeitos da fenpropatrina e cipermetrina sobre a atividade do Nav1.5h e avaliar o potencial da mexiletina e ranolazina em atenuar esses efeitos. Métodos: Os canais NaV1.5h foram transitoriamente expressos em células embrionárias de rim humano, linhagem 293 (HEK293). A mensuração da corrente de Na+ (INa) foi realizada por meio da configuração célula inteira usando a técnica de Patch-Clamp, na modalidade voltage-clamp. Resultados: Foram realizadas curvas concentração-efeito dos piretroides (0,01-100 µM), na qual a fenpropatrina e cipermetrina induziram um aumento da INa,T de maneira dependente da concentração, com EC50 estimados de 0,4 ± 0,1 µM e 0,9 ± 0,2 µM, respectivamente. O aumento da INa,T também foi evidente em diferentes potenciais de membrana após exposição aos piretroides. Similarmente, os piretroides afetaram a dependência de voltagem para ativação do Nav1.5h, promovendo um deslocamento da curva de ativação para potenciais de membrana mais negativos. Também causaram um retardo na recuperação da inativação. Apenas a cipermetrina alterou a dependência de voltagem para inativação no estado estacionário, com deslocamento da curva de inativação para potenciais de membrana mais negativos. A mexiletina foi capaz de atenuar a alteração induzida por ambos os pesticidas, por outro lado, a ranolazina reduziu significativamente apenas INa,T gerada pela fenpropatrina. Conclusões: Os piretroides fenpropatrina e cipermetrina induzem alterações na INa e nas propriedades biofísicas de canais NaV1.5h, dos quais podem ser mitigados pela mexiletina ou ranolazina, a depender do piretroide.
- ItemEfeitos da intoxicação alcoólica durante a adolescência e do exercício físico durante a abstinência protraída sobre o comportamento e as alterações moleculares no hipocampo de camundongos Swiss(Universidade Federal de São Paulo, 2024-03-01) Righi, Thamires [UNIFESP]; Cruz, Fábio Cardoso [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4804337113083801; http://lattes.cnpq.br/1045627602468740As modificações funcionais cognitivas e comportamentais ocorridas durante a adolescência tornam os adolescentes mais predispostos a iniciarem o uso de etanol ou outras drogas. Alterações nos sistemas relacionados ao estresse crônico, aos processos neuroinflamatórios e às vias de autofagia e neuroplasticidade podem mediar a transição do uso ocasional para o uso compulsivo. O uso de terapias alternativas, como o exercício físico, tem sido um grande aliado no tratamento da dependência e dos problemas neurológicos a ela associados, como por exemplo, os sintomas negativos associados à síndrome de abstinência. Dessa forma, o presente estudo investigou as alterações no padrão de consumo de camundongos Swiss submetidos a diferentes protocolos de intoxicação de etanol, alterações na expressão do BDNF e mTORC, de células da glia, das proteínas autofágicas e nos testes comportamentais decorrentes da interação entre intoxicação de etanol na adolescência e exercício físico forçado durante a fase de abstinência protraída na região do hipocampo desses animais. Observamos que os animais intoxicados por etanol, no modelo de administração intraperitoneal, apresentaram redução no peso corporal durante a intoxicação e aumento na expressão de CRF após a exposição ao etanol e ao exercício físico. Os animais intoxicados por etanol, no modelo cíclico de exposição ao vapor de etanol, apresentaram redução no peso corporal e aumento no consumo voluntário na segunda semana de exposição ao etanol. O isolamento social associado ao modelo de exposição crônica estendida ao vapor de etanol diminuiu a evocação da memória de longo prazo, aumentou os comportamentos tipo depressivos e diminuiu a expressão das proteínas mTOR e BDNF no hipocampo desses animais. O exercício físico aumentou o desempenho no teste de velocidade máxima e a cognição dos animais. Concluiu-se que o consumo excessivo e a intoxicação crônica de ETOH foram fortes preditores para o aparecimento tardio de transtornos relacionados ao uso dessa substância, assim como danos neurocognitivos persistentes.
- ItemAnálise da incorporação de ácidos graxos ômega-3 (EPA e DHA) na membrana celular de mioblastos C2C12: avaliação dos efeitos na proliferação e diferenciação celular(Universidade Federal de São Paulo, 2023-09-11) Monteiro, Daniela Carvalho [UNIFESP]; Moreira, Vanessa [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1310560200014128; http://lattes.cnpq.br/4745332502370423Objetivo: Analisar o grau de incorporação dos ácidos graxos do tipo ômega-3 ácido eicosapentaeinoico (EPA) e docosahexaenoico (DHA) em membrana de mioblastos C2C12 cultivados em cultura celular e suplementado com nanoemulsão de óleo de peixe (NOP). Avaliar esse efeito sobre a proliferação e diferenciação destas células miogênicas com especial ênfase na resolvina E1 (RvE1). Métodos: Células C2C12 mioblásticas de camundongo foram cultivadas com NOP (25 µM de EPA) por 3 a 5 dias em protocolo de cultivo das células em proliferação ou diferenciação, respectivamente. A análise do grau de incorporação de EPA e DHA foi realizada em cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG/MS). De outra parte, as células foram previamente incubadas com inibidor do receptor de BLT1 (LY293111- 0,25 M) ou com os inibidores da via de sinalização do receptor CMKLR1/ChemR23 (rapamicina, 0,08 µM- inibidor de mTOR, ou wortmanina, 500 nM, inibidor de PI3K) seguida pela fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de Crotalus durissus terrificus (0,16 M). Após 24 h, foram realizadas as análises da expressão proteica de BLT1, COX-2, CYP450, MyoD e Myf-5 (proliferação) e CMKLR1/ChemR23 e Myf-6 (diferenciação) por western blotting. Ainda o grau de proliferação foi analisado pelo padrão de incorporação de BrDU, por espectrofotometria. Resultados: Os resultados mostraram que as células cultivadas com NOP, em meio proliferativo, apresentaram aumento (p>0,05) no teor de EPA e DHA (118,41±13,51 e 5,43±0,64 µg/mg, respectivamente), quando comparadas às células controle (18, 91±2.24 e 0,74±0,10 µg/mg de proteína, respectivamente). De forma semelhante, mioblastos incubados por 6 dias com NOP até atingir a confluência de 100% (protocolo experimental de diferenciação) apresentaram elevação (p<0,05) no teor de EPA e DHA (139,41 ±24,0 e 70,63 ± 11,43 µg/mg de proteína, respectivamente), quando comparadas às células incubadas com meio de cultura apenas (controle) (45,96 ± 1,44 e 16,23 ± 1,07 µg/mg de proteína, respectivamente). Apenas as células em proliferação incubadas com FLA2 e suplementadas com NOP apresentaram aumento de 25% e 30%, nos níveis de expressão proteica de COX-2 e CYP450 4A (p<0,05), respectivamente. As células em proliferação, incubadas com FLA2 e não suplementadas com NOP apresentaram aumento nos níveis de BLT1 (35%), enquanto as em diferenciação apresentaram diminuição de 60% na expressão deste receptor. Quando suplementadas com NOP não apresentaram alteração na expressão de BLT1. Apenas mioblastos em diferenciação e incubadas com FLA2 apresentaram redução da expressão de CMKLR1 (35%). Mioblastos suplementados ou não com NOP, na presença da FLA2, apresentaram aumento significativo de 90 e 25%, respectivamente, na incorporação do BrdU. Por outro lado, a associação com com Ly293111, levou à diminuição significativa de 26 e 43%, na incorporação do BrdU. As células incubadas com FLA2 e o inibidor do receptor BLT1 (Ly293111) apresentaram redução significativa da expressão de Myf5 e MyoD enquanto as células em prolfieração com NOP não apresentaram alteração nos níveis de expressão proteica destes fatores miogênicos. Células em diferenciação cultivadas com NOP e FLA2 apresentam diminuição da expressão de MyoD de forma significativa (15%). No entanto, estas células quando incubadas com FLA2 associada ao rapamicina, mas não com wortmanina ou Ly293111, apresentaram elevação significativa (65%) da expressão de MyoD. A análise morfológica da miofibras em células C2C12 pré-suplementadas com NOP indicou a formação de fibras mais espessas. Conclusões: A suplementação de mioblastos C2C12 com NOP aumenta a incorporação de EPA e DHA, favorecendo a produção de mediadores lipídicos pró-resolutivos. A presença de receptores BLT1 e do receptor CMKLR1/ChemR23 evidencia a atividade modulatória de RVE1 sobre a proliferação e diferenciação dos mioblastos C2C12; o aumento da proliferação das células C2C12 induzida pela FLA2 via receptor BLT1 pode ser mediada pela RVE1, mas independente dos fatores Myf5 e MyoD; Mioblastos suplementadas com EPA e DHA apresentam mais formação de miotubos espessos.
- ItemInfluência do estresse de separação materna sobre os comportamentos relacionados ao consumo de etanol em camundongos: análise da neurotransmissão CRFérgica(Universidade Federal de São Paulo, 2024-03-04) Bertagna, Natalia Bonetti [UNIFESP]; Cruz, Fábio Cardoso [UNIFESP]; Miguel, Tarciso Tadeu; http://lattes.cnpq.br/4650584679300472; http://lattes.cnpq.br/4804337113083801; http://lattes.cnpq.br/4813702576316014O transtorno por uso de etanol (TUE) é um transtorno multifatorial, sendo o estresse um importante fator de risco envolvido na iniciação, manutenção e recaída ao consumo de etanol. Experiências adversas na infância podem favorecer alterações moleculares duradouras que, aumentam a vulnerabilidade para o desenvolvimento do TUE. Em roedores, o protocolo de estresse de separação materna (SM) é reconhecido como um modelo preditivo para investigar os efeitos da exposição ao estresse na infância sobre o consumo de etanol na vida adulta. A amídala estendida, formada pela borda do núcleo accumbens (NAc shell), amídala central (CeA) e no núcleo intersticial da estria terminal (BNST), é conhecida pelo seu papel na mediação dos comportamentos relacionados ao estresse e consumo de etanol. A ativação do sistema do fator liberador de corticotrofina (CRF) na amídala estendida, particularmente na amídala (AMY) e no BNST, parecem estar envolvidas nessas respostas. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos a longo prazo da SM nos comportamentos de consumo de etanol em camundongos machos e fêmeas, bem como o envolvimento do sistema CRFérgico da AMY e BNST na interação entre estresse de SM e o consumo de etanol nesses roedores. Para isso, camundongos C57BL/6J machos e fêmeas foram separados diariamente de suas mães por três horas do dia pós-natal (DPN) 1 até o DPN 14. Os animais controle foram mantidos nas gaiolas moradia, sob os cuidados maternos até o DPN 21, quando ocorreu o desmame de todas as ninhadas. No primeiro experimento, a partir do DPN 45, os camundongos (Controle: n= 14, 7 machos e 7 fêmeas; SM: n= 14, 7 machos e 7 fêmeas) foram submetidos ao protocolo de consumo involuntário de etanol 20%, durante 3 semanas. Após, foi realizada a aquisição do comportamento de autoadministração operante de etanol em esquema de razão fixa (RF 1-3-5), em sessões de 2 horas, por 3 semanas. Em seguida, foi avaliada a influência da SM sobre a motivação pela busca do etanol 20% utilizando o protocolo de razão progressiva em 3 sessões de 2 horas. O consumo operante ilimitado de etanol 20% foi avaliado em uma sessão de binge com 4 horas de duração. Vinte e quatro horas após a sessão de binge, a busca pelo etanol 20% frente a um estímulo aversivo foi avaliada quando concentrações crescentes de quinino foram adicionadas a solução de etanol. O envolvimento dos subnúcleos da amídala estendida foi avaliado através da expressão da contagem do número de células positivas para a proteína Fos no Nac, AMY e BNST. No segundo experimento, foram utilizados os mesmos protocolos de SM e autoadministração de etanol (SM: n=31; 15 fêmeas e 16 machos; Controle: n=29; 15 fêmeas e 14 machos), porém, após o protocolo de razão progressiva, os animais foram alocados em dois grupos distintos: expostos (Controle: 8 fêmeas, 8 machos; SM: 7 fêmeas, 9 machos) e não expostos (Controle: 7 fêmeas e 6 machos; SM: 8 fêmeas, 7 machos) ao teste de Exposição ao Rato (TER). Após a exposição ao TER, os animais foram submetidos a uma sessão de binge e amostras da AMY e do BNST foram coletadas para análise da expressão dos receptores CRFR1 e CRFR2 e da proteína de ligação ao CRF (CRF-BP), por Western Blotting. Amostras de sangue foram coletadas antes do início do protocolo de autoadministração, depois do TER e do binge, para a análise das concentrações de corticosterona plasmática. No terceiro experimento, a partir do DPN 60, camundongos machos e fêmeas dos grupos controle e SM foram submetidos ao protocolo de livre escolha de etanol ou água, no qual a concentração da solução de etanol foi aumentada a cada 3 dias (5%, 10%, 15% e 20%). Em seguida os animais foram submetidos a uma cirurgia estereotáxica para a implantação de cânulas no BNST. Após esse procedimento foram realizados três dias de consumo voluntário de etanol 20% intercalados por três dias de abstinência, em que um grupo de animais controles e SM recebeu injeções intra-BNST de veículo e CP 376395 (antagonista de receptores CRFR1, doses 3,0 nmol/0,1 μl e 6,0 nmol/0,2 μl) e outro grupo de recebeu veículo e CRF6-33 (inibidor da proteína CRF-BP, doses 0,25 μg/0,1 μl e 0,5 μg/0,2 μl) que foram administrados seguindo o esquema Latin Square. No experimento 1, os resultados demonstram que a SM aumentou a ingestão de etanol em camundongos fêmeas, enquanto diminuiu o consumo em machos no consumo involuntário. Os animais submetidos SM apresentaram maior motivação para buscar etanol durante o protocolo de razão progressiva. Camundongos fêmeas do grupo controle, assim como machos submetidos a SM, foram mais resistentes a reduzir seu consumo em relação aos camundongos machos controle durante a adulteração com quinino. Para a imunohistoquímica, observamos aumento de neurônios imunorreativos para Fos na BLA e CeA em camundongos submetidos ao MS, mas não no NAc, nem no BNST. Já para o experimento 2, a SM induziu efeitos duradouros nas respostas comportamentais a um estressor heterotípico durante a vida adulta e na busca pelo etanol após a exposição ao TER, de maneira sexo-específica. Camundongos machos que permaneceram mais tempo na toca apresentaram maior número de reforços e respostas ao nose poke ativo em relação quando comparados às fêmeas. Camundongos dos grupos SM que não foram submetidos ao TER apresentaram redução da expressão de receptores CRFR1 no BNST e CRF-BP na AMY, enquanto aqueles que foram expostos ao TER apresentaram aumento na expressão de CRFR2 na AMY. No experimento 3, foi observado que a Sm reduziu o consumo de etanol em um protocolo de livre escolha de etanol com concentrações crescentes dessa substância. Esses efeitos não foram influenciados pelo antagonismo de receptores CRFR1 com CP376395. A inibição da proteína CRF-BP não produziu alterações de consumo e preferência de consumo entre os grupos. Esse estudo demonstra que a SM produziu alterações duradouras nos comportamentos relacionados ao consumo de etanol, de modo dependente de sexo e em diferentes protocolos de autoadministração de etanol. Observa-se também que esse estresse influencia comportamentos defensivos e o consumo de etanol em resposta a um estressor heterotípico, na vida adulta. Tais respostas foram associadas a ativação neuronal específica de subnúcleos da amídala estendida, de forma sexo-específica. Destaca-se, ainda, que a separação materna alterou a expressão de proteínas relacionadas ao sistema CRFérgico na amídala estendida. Entretanto, o antagonismo de receptores CRFR1 e a inibição da proteína CRF-BP parecem não influenciar os efeitos do estresse de SM sobre o consumo de etanol.