Análise da incorporação de ácidos graxos ômega-3 (EPA e DHA) na membrana celular de mioblastos C2C12: avaliação dos efeitos na proliferação e diferenciação celular
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Data
2023-09-11
Autores
Monteiro, Daniela Carvalho [UNIFESP]
Orientadores
Moreira, Vanessa [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Objetivo: Analisar o grau de incorporação dos ácidos graxos do tipo ômega-3 ácido eicosapentaeinoico (EPA) e docosahexaenoico (DHA) em membrana de mioblastos C2C12 cultivados em cultura celular e suplementado com nanoemulsão de óleo de peixe (NOP). Avaliar esse efeito sobre a proliferação e diferenciação destas células miogênicas com especial ênfase na resolvina E1 (RvE1). Métodos: Células C2C12 mioblásticas de camundongo foram cultivadas com NOP (25 µM de EPA) por 3 a 5 dias em protocolo de cultivo das células em proliferação ou diferenciação, respectivamente. A análise do grau de incorporação de EPA e DHA foi realizada em cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG/MS). De outra parte, as células foram previamente incubadas com inibidor do receptor de BLT1 (LY293111- 0,25 M) ou com os inibidores da via de sinalização do receptor CMKLR1/ChemR23 (rapamicina, 0,08 µM- inibidor de mTOR, ou wortmanina, 500 nM, inibidor de PI3K) seguida pela fosfolipase A2 (FLA2) isolada do veneno de Crotalus durissus terrificus (0,16 M). Após 24 h, foram realizadas as análises da expressão proteica de BLT1, COX-2, CYP450, MyoD e Myf-5 (proliferação) e CMKLR1/ChemR23 e Myf-6 (diferenciação) por western blotting. Ainda o grau de proliferação foi analisado pelo padrão de incorporação de BrDU, por espectrofotometria. Resultados: Os resultados mostraram que as células cultivadas com NOP, em meio proliferativo, apresentaram aumento (p>0,05) no teor de EPA e DHA (118,41±13,51 e 5,43±0,64 µg/mg, respectivamente), quando comparadas às células controle (18, 91±2.24 e 0,74±0,10 µg/mg de proteína, respectivamente). De forma semelhante, mioblastos incubados por 6 dias com NOP até atingir a confluência de 100% (protocolo experimental de diferenciação) apresentaram elevação (p<0,05) no teor de EPA e DHA (139,41 ±24,0 e 70,63 ± 11,43 µg/mg de proteína, respectivamente), quando comparadas às células incubadas com meio de cultura apenas (controle) (45,96 ± 1,44 e 16,23 ± 1,07 µg/mg de proteína, respectivamente). Apenas as células em proliferação incubadas com FLA2 e suplementadas com NOP apresentaram aumento de 25% e 30%, nos níveis de expressão proteica de COX-2 e CYP450 4A (p<0,05), respectivamente. As células em proliferação, incubadas com FLA2 e não suplementadas com NOP apresentaram aumento nos níveis de BLT1 (35%), enquanto as em diferenciação apresentaram diminuição de 60% na expressão deste receptor. Quando suplementadas com NOP não apresentaram alteração na expressão de BLT1. Apenas mioblastos em diferenciação e incubadas com FLA2 apresentaram redução da expressão de CMKLR1 (35%). Mioblastos suplementados ou não com NOP, na presença da FLA2, apresentaram aumento significativo de 90 e 25%, respectivamente, na incorporação do BrdU. Por outro lado, a associação com com Ly293111, levou à diminuição significativa de 26 e 43%, na incorporação do BrdU. As células incubadas com FLA2 e o inibidor do receptor BLT1 (Ly293111) apresentaram redução significativa da expressão de Myf5 e MyoD enquanto as células em prolfieração com NOP não apresentaram alteração nos níveis de expressão proteica destes fatores miogênicos. Células em diferenciação cultivadas com NOP e FLA2 apresentam diminuição da expressão de MyoD de forma significativa (15%). No entanto, estas células quando incubadas com FLA2 associada ao rapamicina, mas não com wortmanina ou Ly293111, apresentaram elevação significativa (65%) da expressão de MyoD. A análise morfológica da miofibras em células C2C12 pré-suplementadas com NOP indicou a formação de fibras mais espessas. Conclusões: A suplementação de mioblastos C2C12 com NOP aumenta a incorporação de EPA e DHA, favorecendo a produção de mediadores lipídicos pró-resolutivos. A presença de receptores BLT1 e do receptor CMKLR1/ChemR23 evidencia a atividade modulatória de RVE1 sobre a proliferação e diferenciação dos mioblastos C2C12; o aumento da proliferação das células C2C12 induzida pela FLA2 via receptor BLT1 pode ser mediada pela RVE1, mas independente dos fatores Myf5 e MyoD; Mioblastos suplementadas com EPA e DHA apresentam mais formação de miotubos espessos.
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Citação
MONTEIRO, Daniela Carvalho. Análise da incorporação de ácidos graxos ômega-3 (EPA e DHA) na membrana celular de mioblastos C2C12: avaliação dos efeitos na proliferação e diferenciação celular. 2023. 75 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, 2023.