Expressão, purificação, cristalização e análise preliminar de dados cristalográficos da proteína csm4 de thermotoga marítima
Data
2015-11-30
Autores
Villegas, Nadia Valeria Gavilan 
Orientadores
Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Bacteria and Archaea have developed a defense system against exogenous DNA and RNA, called CRISPR (Clustered Regularly Intespaced Short Palindromic Repeats), which consists of an operon composed of regions of repetitions (repeats) identical to each other, separated by variable regions (spacers) from invading nucleic acids, along with associated proteins (Cas proteins, CRISPR associated proteins) forming an adaptive and heritable immune system. The main objective of this project was to clone, express and purify in recombinant form the Csm4 protein from T. maritima MSB8, and to characterize structurally this protein. This protein is part of a marginally studied complex of Cas ribonucleoproteins termed the Csm complex, which is involved in the targetting of exogenous DNA from bacteriophages and horizontal transfer of nucleic acids. The protein was recombinantly produced in E. coli and purified by affinity chromatography and gel filtration. After concentration, the protein was crystallized in space group P422 with unit cell a=67,5 b=67,5 c=84,8 Å. Data obtained showed that the native crystal diffracts to 2,5 Å at a wavelength of 1,458 Å. In order to solve the structure by MIR other crystals of derivatized protein with platinum and iodide diffracted up to 3,49 and 4,02 Å at wavelengths of 1,06007 and 1,54160 Å, respectively. Additionally, we incorporated selenomethionine into the protein to be able to solve the structure by the MAD (Multi-wavelength Anomalous Diffraction) methodology. These results can serve as a basis for implementing future projects of rational and experimental design of inhibitors in order to prevent the proliferation of these organisms.
As bactérias e as arqueas têm desenvolvido um sistema de defesa contra DNA e RNA exógenos, denominado CRISPR (Clustered Regularly Intespaced Short Palindromic Repeats) que consiste em um óperon composto por regiões de repetições (repeats) idênticas entre si, separadas por regiões variáveis (spacers) provenientes dos ácidos nucleicos invasores, junto com proteínas associadas (proteínas Cas, CRISPR associated proteins) que formam um sistema imune adaptativo e herdável das bactérias. O objetivo principal deste projeto foi clonar, expressar e purificar de forma recombinante a enzima Csm4 de T. marítima MSB8, relacionada ao sistema CRISPR visando caracterizar estruturalmente esta proteína. Esta proteína integra um complexo de ribonculeoproteínas Cas menos estudadas, o complexo Csm, que está envolvido no processamento de DNA exógeno proveniente de bacteriófagos e de transferência horizontal de ácidos nucleicos. A proteína foi produzida de forma recombinante em E.coli e purificada por cromatografia de afinidade e filtração em gel. Após concentração, a proteína foi cristalizada no grupo espacial P422 com célula unitária a=67,5 b=67,5 c=84,8 Å. Dados obtidos no LNLS mostram que o cristal nativo difrata até 2,5 Å no comprimento de onda de 1,458 Å. Para resolver a estrutura pelo método de MIR, outros cristais da proteína derivatizados com platina e iodeto difratam a 3,49 e 4,02 Å nos comprimentos de onda de 1,06007 e 1,54160 Å, respectivamente. Adicionalmente, produzimos proteína com selenometionina incorporada para obter os dados cristalográficos e resolver a estrutura pela metodologia MAD (Multi-wavelength Anomalous Diffraction, Difração Anómala Múltipla). Estes resultados podem servir como base para implementar futuros projetos de desenho racional e experimental de inibidores com a finalidade de impedir a proliferação destes organismos.
As bactérias e as arqueas têm desenvolvido um sistema de defesa contra DNA e RNA exógenos, denominado CRISPR (Clustered Regularly Intespaced Short Palindromic Repeats) que consiste em um óperon composto por regiões de repetições (repeats) idênticas entre si, separadas por regiões variáveis (spacers) provenientes dos ácidos nucleicos invasores, junto com proteínas associadas (proteínas Cas, CRISPR associated proteins) que formam um sistema imune adaptativo e herdável das bactérias. O objetivo principal deste projeto foi clonar, expressar e purificar de forma recombinante a enzima Csm4 de T. marítima MSB8, relacionada ao sistema CRISPR visando caracterizar estruturalmente esta proteína. Esta proteína integra um complexo de ribonculeoproteínas Cas menos estudadas, o complexo Csm, que está envolvido no processamento de DNA exógeno proveniente de bacteriófagos e de transferência horizontal de ácidos nucleicos. A proteína foi produzida de forma recombinante em E.coli e purificada por cromatografia de afinidade e filtração em gel. Após concentração, a proteína foi cristalizada no grupo espacial P422 com célula unitária a=67,5 b=67,5 c=84,8 Å. Dados obtidos no LNLS mostram que o cristal nativo difrata até 2,5 Å no comprimento de onda de 1,458 Å. Para resolver a estrutura pelo método de MIR, outros cristais da proteína derivatizados com platina e iodeto difratam a 3,49 e 4,02 Å nos comprimentos de onda de 1,06007 e 1,54160 Å, respectivamente. Adicionalmente, produzimos proteína com selenometionina incorporada para obter os dados cristalográficos e resolver a estrutura pela metodologia MAD (Multi-wavelength Anomalous Diffraction, Difração Anómala Múltipla). Estes resultados podem servir como base para implementar futuros projetos de desenho racional e experimental de inibidores com a finalidade de impedir a proliferação destes organismos.
Descrição
Citação
VILLEGAS, Nadia Valeria Gavilan. Expressão, purificação, cristalização e análise preliminar de dados cristalográficos da proteína csm4 de thermotoga marítima. 2015. 81 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São José dos Campos, 2015.