Estudo da ligação e internalização do lipopolissacarídeo e indução de ativação celular, avaliada individualmente em sangue total: interferência do ácido etilenodiaminoteraácetico (EDTA) e heparina

Brunialti, Milena Karina Coló [UNIFESP]

Estudo da ligação e internalização do lipopolissacarídeo e indução de ativação celular, avaliada individualmente em sangue total: interferência do ácido etilenodiaminoteraácetico (EDTA) e heparina

Data

2000

Autores

Brunialti, Milena Karina Coló

Orientadores

Salomão, Reinaldo

Tipo

Dissertação de mestrado

Resumo

Varios trabalhos demonstraram que o monocito, quando estimulado pelo LPS, desempenha importante papel na resposta inflamatoria. Neste trabalho avaliamos a cinetica e dose-resposta de ligacao e internalizacao do LPS a monocitos, e da ativacao de subpopulacoes leucocitarias por expressao de mercadores de ativacao na superficie celular e deteccao de TNF-a intracelular induzidos pelo LPS, utilizando a citometria de fluxo, em sangue total. A influencia dos anticoagulantes, heparina e EDTA, tambem foram determinadas nas variaveis acima citadas. O sangue foi obtido de doadores sadios em tubo a vacuo contendo EDTA ou heparina. LPS conjugado a biotina (LPSB) foi usado para avaliar a ligacao e internalizacao do LPS as celulas em sangue total. Amostras sem LPS foram utilizadas como controle. Apos a incubacao, o sangue foi lavado e as hemacias lisadas. Posteriormente as celulas foram marcadas com CDl4-FITC, CD4PerCP, CD3-APC, CDl9-APC. A deteccao de LPSB foi feita pela adicao de estreptavidina-red670 ou estreptavidina-APC. Para verificar a expressao de mercadores de ativacao na superficie celular e citocina intracelular induzidos pelo LPS utilizaram-se CD69-FITC e HLA-DR-PE, e anticorpo anti-TNF-a humano-APC, respectivamente. A leitura dos resultados foi realizada em citometro de fluxo. As aquisicoes e analises foram realizadas no programa CellQuest. Para estabelecer a melhor dose de LPSB utilizaram-se diferentes concentracoes (O, 200, 1.000 e 5.000 ng/ml) incubando-as por uma hora. A dose de 5.000 ng/ml foi considerada ideal por apresentar 93 por cento dos monocitos ligados ao LPS. A especificidade do LPSB foi testada com pre incubacao de LPS nao marcado variando-se as doses (O, 5.000 e 20.000 ng/ml). Notou-se com 5.000 ng/ml um bloqueio de 99 por cento da ligacao do LPSB. Para verificar o tempo necessario de ligacao do LPSB ao monocito empregou-se tempos de incubacao de 5, 60, 120 e 240 minutos. O LPSB liga-se prontamente ja 5 minutos aos monocitos presentes em sangue total tanto em EDTA quanto em heparina. Nas amostras colhidas em EDTA observou-se uma diminuicao da deteccao desta ligacao a partir de 60 minutos de incubacao, nao sendo mais detectado em 240 minutos. Este fenomeno foi acompanhado por aumento da expressao de HLA-DR na superficie dos monocitos. Em contraste, a ligacao do LPSB a membrana mantem-se detectavel no sangue tratado com heparina numa proporcao muito maior de celulas. A adicao de ...(au)