Caracterizacao de endopeptidase hepatica cinino-inativadora

Molina, Hercilia Maris [UNIFESP]

Caracterizacao de endopeptidase hepatica cinino-inativadora

Data

1998

Autores

Molina, Hercilia Maris

Tipo

Dissertação de mestrado

Resumo

Verificamos em trabalhos anteriores que o figado perfundido possui grande capacidade de inativar a bradiclnina e purificamos cininase cininoinativadora. Removemos do figado, e purificamos, esta endopeptidase cininoinativadora (BIE). Sua remocao do ligado de rato previamente exsanguinado foi obtida perfundindo-se o orgao com Krebs-Henseleit-bicarbonato contendo Triton X-IOO O,05 por cento . A localizacao celular da enzima pode ser suposta (pela quantificacao de enzimas co-removidas) mas novos experimentos sao necessarios para demonstra-la. A purificacao da cininase envolveu as etapas de cromatografia em coluna de troca ionica (QAE Cellex), coluna de gel filtracao (Sephacryl S- 300) e coluna de afinidade em coluna de Blue Sepharose CL-6B. A enzima purlficada (BIE) hidrolisa eficientemente os substratos analogos a bradicinlna: Abz-R-P-P-G-F-S-P-F-R-EDDnp (na ligacao F 5S6 ) e Abz-R-P-P-G-F-S-P-F-R-Q-EDDnp (na ligacao P7F 8) . A Introdução do residuo de glutamina na posicao C-terminal da bradicinlna mudou a ligacao de hidrolise, por mecanismo ainda nao elucidado. O substrato Abz-F-R-K(Dnp)P, preferencial da enzima conversara de 2 3) anglotensina (ECA), foi hidrolisado pela BIE (na ligacao R K com efiCiência desprezivel, quando comparada a da ECA. A atividade da BIE foi 'n'bida por reagentes bloqueadores de grupo tiol (p-CXM), indicando que a enzima contem pelo menos um grupo tiol livre e importante para sua atividade; a adicao de cisteina ao meio de incubacao reverteu a inibicao. A BIE foi tambem inibida por inlbidores inespecificos de cisteinoproteases (p- e Ac Hg), que reagem com a sulfidrila de residuos de cisteina. A endopeptidase nao foi inibida por lnibidor especifico de I cisteinoproteases (E64), sugerindo que o residuo de cisteina, embora essencial Para sua atividade, nao esta no sitio ativo da enzima. A cininase foi inibida por agentes quelantes (EDTA e orto-fenantrolina), mas nao por captopril e enalapril (inibidores especificos da ECA). Estes resultados sugerem ser a BIE metaloendopeptidase, contendo grupo tiol importante para sua atividade. Estas caracteristicas bioquimicas sao vi similares as descritas para a enzima EC 3.4.24.14 (thimet oligoendopeptidase, TOP). A BIE tem a mesma migracao eletroforetica (PAGE) da EC 3.4.24.15 e em immunoblotting reconhece o anticorpo especifico antl-EC 3.4.24.15. As duas enzimas hidrolisam os substratos Abz-R-P-P-G-F-S-P-F-R-EDDnp e Abz-G-G-F-L-R-R-V-EDDnp (analogo a dinorfina A....(au)