Efeito Do Condroitim Sulfato Na Fibrogênese Hepática Induzida Por Ligadura Do Ducto Biliar Em Ratos
Data
2017-10-26
Autores
Guedes, Pedro Luiz Rodrigues 
Orientadores
Nagaoka, Márcia Regina
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Background and Aims: One of the many causes of hepatic fibrosis is cholestasis, which causes cell death and triggers cytokines and chemokines release, leading to leukocyte infiltration and extracellular matrix deposition. The current treatment of hepatic fibrosis is based on withdrawal of the causing agent, so the investigation of new and effective strategies for the treatment of liver fibrosis is very important. Many studies highlight the action of chondroitin sulfate (CS) in different cell types, leading to the reduction of cytokines expression. The aim of this work was to analyze effects of CS on experimental model of extra-hepatic cholestasis induced by common bile duct ligation (BDL). Methods: Wistar rats (6-8 weeks) were submitted to BDL, treated with CS (120 mg/kg body) or vehicle for 1, 2, 7, 14, 21 or 28 days intraperitoneally, and then euthanized; sham animals were used as control. We analyzed serum alanine and aspartate aminotransferases (ALT and AST, respectively) activities and performed histomorphometric analysis on Picrosirius-stained liver specimens using the Axiovision software. To analyze cell death and inflammation, caspase-3 and cathepsin B activities on liver homogenates were measured using fluorometric substrates Ac-DEVD-AMC and Abz-GIVRAK(Dnp)-OH, respectively. Apoptosis was also evaluated by TUNEL assay and liver regeneration by immunohistochemical staining for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) using monoclonal primary anti-PCNA antibody. Statistical analysis of standardized values was performed by one-way ANOVA with Tukey’s post-hoc. Results are expressed by mean±SEM. Results: BDL rats presented ALT and AST serum activities 2-3 times greater than sham. BDL led to progressive fibrotic septa development, which was confirmed by measuring collagen content (% field) after 7 (11±1, n = 7), 14 (14±1, n = 10), 21 (23±1, n = 4) and 28 (34±3, n = 7) days of induction, while sham group preserved normal liver architecture. CS treatment reduced collagen content on BDL group after 21 days (14±1, n = 6) and significantly (p<0.0001) after 28 days (16±2, n = 6). There were no significant changes on cathepsin B activities of all studied groups. We verified increasing caspase-3 activity (fold sham) on BDL 2d (1.4±0.1, n = 5), 7d (2.2±0.6, n = 7) and 14d (3.3 ± 0.5, n = 10; ANOVA, p < 0.001) when compared to the respective sham groups. Interestingly, CS reduced significantly (p=0.043) the caspase-3 activity after 14 days of treatment (1,7 ±0.7, n = 9) when compared to BDL 14d group. BDL animals had a higher number of apoptotic cells per field (% of total) at 14d (0.58±0.04) than those at 7 (0.25±0.02), 21 (0.33±0.02)and 28 days groups (0.29±0.01). Treatment with CS reduced significantly (p = 0.030) the number of apoptotic cells in the 14d group (0.43±0.04). In addition, BDL led to an increase in the relative amount (% of total) of PCNA-labeled epithelial biliary cells and hepatocytes. Treatment with CS led increased amounts of marked hepatocytes at 14d (2.9±0.1 – ANOVA; p = 0.003) and 21d (3.5±0.2 - ANOVA; p < 0.001) when compared to non-treated groups (2.1±0.1 and 2.2±0.2 respectively). Conclusions: This work shows that CS may reduce first signs of apoptosis, slow down development of liver fibrosis and therefore cirrhosis, besides promoting liver regeneration on experimental model of common bile duct ligation.
Introdução: Uma das causas de fibrose hepática é a colestase, que causa morte celular e desencadeia a liberação de citocinas e quimiocinas, levando à infiltração de leucócitos e à deposição de matriz extracelular. O tratamento atual da fibrose hepática é baseado na retirada do agente causador, por isso é importante a investigação de estratégias novas e eficazes para o tratamento da fibrose hepática. Muitos estudos destacam a ação do condroitim sulfato em diferentes tipos de células, com consequente redução da expressão de citocinas. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do condroitim sulfato (CS) sobre o modelo experimental de colestase extra-hepática induzida pela ligadura do ducto biliar comum (BDL). Metodologia: Ratos Wistar (6-8 semanas) foram submetidos a BDL e receberão injeção intraperitoneal de CS (120 mg/kg peso) ou veículo por 1, 2, 7, 14, 21 ou 28 dias; os animais sham foram utilizados como controle. Ao final do período de tratamento, os animais foram eutanasiados e amostras de fígado e sangue retiradas. Foram analisadas as atividades de alanina e aspartato aminotransferases séricas (ALT e AST, respectivamente) e, caspase-3 e catepsina B em homogenatos de fígado utilizando os substratos fluorométricos Ac-DEVD-AMC e Abz-GIVRAK(Dnp)-OH, respectivamente. Em espécimes de fígado foi realizada análise morfométrica usando o programa Axiovision 4,8, além de avaliar a apoptose por reação de TUNEL e regeneração hepática por imuno-histoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).. Os resultados foram expressos pela média ± EPM. A análise estatística de valores padronizados foi realizada por ANOVA unidirecional com post-hoc de Tukey. Resultados: Animais BDL apresentaram atividades séricas de ALT e AST 2-3 vezes maiores do que os sham. BDL levou ao progressivo desenvolvimento de septos fibróticos, confirmado pela área de colágeno (%) após 7 (11 ± 1, n = 7), 14 (14 ± 1, n = 10), 21 (23 ± 1, n = 4) e 28 (34 ± 3, n = 7) dias de indução, enquanto os grupos sham tiveram a arquitetura normal do fígado preservada. O tratamento com CS reduziu o conteúdo de colágeno após 21 dias (14 ± 1, n = 6) e significativamente (p <0,001) após 28 dias (16 ± 2, n = 6) em relação ao não-tratado. Não foram observadas alterações significativas nas atividades da catepsina B de todos os grupos estudados. Verificou-se aumento progressivo da atividade da caspase-3 (relativo ao sham) no grupo BDL 2d (1,4 ± 0,1, n = 5), BDL 7d (2,2 ± 0,6, n = 7) e 14d (3,3 ± 0,5, n = 10; ANOVA, p < 0,001) quando comparados aos respectivos grupos sham. Interessante, CS reduziu significativamente (p= 0,024) a atividade de caspase-3 após 14 dias de tratamento (1,7 ±0,7, n = 9) quando comparado com o grupo BDL 14d. Os animais BDL apresentaram mais células apoptóticas por campo (% do total) aos 14 dias (0,58±0,04) do que aos 7 (0,25±0,02), 21 (0,33±0,02) e 28 dias (0,29±0,01). O tratamento com CS reduziu significativamente (p = 0,030) a quantidade de células em apoptose nos animais 14d (0,43±0,04). BDL levou ao aumento significativo na quantidade relativa (%) de células epiteliais biliares e de hepatócitos com núcleo marcado com anti-PCNA. O tratamento com CS levou ao aumento significativo de hepatócitos em proliferação (No relativo) nos animais 14d (2,9±0,1 – ANOVA; p = 0,003) e 21d (3,5±0,2 - ANOVA; p < 0,001) quando comparados aos respectivos BDL não tratados (14d: 2,1±0,1 e 21d: 2,2±0,21). Conclusão: Este trabalho mostra que a CS pode reduzir os primeiros sinais de apoptose, retardar o desenvolvimento de fibrose hepática e, portanto, cirrose, além de promover a regeneração hepática em modelo experimental de ligadura do ducto biliar.
Introdução: Uma das causas de fibrose hepática é a colestase, que causa morte celular e desencadeia a liberação de citocinas e quimiocinas, levando à infiltração de leucócitos e à deposição de matriz extracelular. O tratamento atual da fibrose hepática é baseado na retirada do agente causador, por isso é importante a investigação de estratégias novas e eficazes para o tratamento da fibrose hepática. Muitos estudos destacam a ação do condroitim sulfato em diferentes tipos de células, com consequente redução da expressão de citocinas. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do condroitim sulfato (CS) sobre o modelo experimental de colestase extra-hepática induzida pela ligadura do ducto biliar comum (BDL). Metodologia: Ratos Wistar (6-8 semanas) foram submetidos a BDL e receberão injeção intraperitoneal de CS (120 mg/kg peso) ou veículo por 1, 2, 7, 14, 21 ou 28 dias; os animais sham foram utilizados como controle. Ao final do período de tratamento, os animais foram eutanasiados e amostras de fígado e sangue retiradas. Foram analisadas as atividades de alanina e aspartato aminotransferases séricas (ALT e AST, respectivamente) e, caspase-3 e catepsina B em homogenatos de fígado utilizando os substratos fluorométricos Ac-DEVD-AMC e Abz-GIVRAK(Dnp)-OH, respectivamente. Em espécimes de fígado foi realizada análise morfométrica usando o programa Axiovision 4,8, além de avaliar a apoptose por reação de TUNEL e regeneração hepática por imuno-histoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).. Os resultados foram expressos pela média ± EPM. A análise estatística de valores padronizados foi realizada por ANOVA unidirecional com post-hoc de Tukey. Resultados: Animais BDL apresentaram atividades séricas de ALT e AST 2-3 vezes maiores do que os sham. BDL levou ao progressivo desenvolvimento de septos fibróticos, confirmado pela área de colágeno (%) após 7 (11 ± 1, n = 7), 14 (14 ± 1, n = 10), 21 (23 ± 1, n = 4) e 28 (34 ± 3, n = 7) dias de indução, enquanto os grupos sham tiveram a arquitetura normal do fígado preservada. O tratamento com CS reduziu o conteúdo de colágeno após 21 dias (14 ± 1, n = 6) e significativamente (p <0,001) após 28 dias (16 ± 2, n = 6) em relação ao não-tratado. Não foram observadas alterações significativas nas atividades da catepsina B de todos os grupos estudados. Verificou-se aumento progressivo da atividade da caspase-3 (relativo ao sham) no grupo BDL 2d (1,4 ± 0,1, n = 5), BDL 7d (2,2 ± 0,6, n = 7) e 14d (3,3 ± 0,5, n = 10; ANOVA, p < 0,001) quando comparados aos respectivos grupos sham. Interessante, CS reduziu significativamente (p= 0,024) a atividade de caspase-3 após 14 dias de tratamento (1,7 ±0,7, n = 9) quando comparado com o grupo BDL 14d. Os animais BDL apresentaram mais células apoptóticas por campo (% do total) aos 14 dias (0,58±0,04) do que aos 7 (0,25±0,02), 21 (0,33±0,02) e 28 dias (0,29±0,01). O tratamento com CS reduziu significativamente (p = 0,030) a quantidade de células em apoptose nos animais 14d (0,43±0,04). BDL levou ao aumento significativo na quantidade relativa (%) de células epiteliais biliares e de hepatócitos com núcleo marcado com anti-PCNA. O tratamento com CS levou ao aumento significativo de hepatócitos em proliferação (No relativo) nos animais 14d (2,9±0,1 – ANOVA; p = 0,003) e 21d (3,5±0,2 - ANOVA; p < 0,001) quando comparados aos respectivos BDL não tratados (14d: 2,1±0,1 e 21d: 2,2±0,21). Conclusão: Este trabalho mostra que a CS pode reduzir os primeiros sinais de apoptose, retardar o desenvolvimento de fibrose hepática e, portanto, cirrose, além de promover a regeneração hepática em modelo experimental de ligadura do ducto biliar.