Estudos estruturais e funcionais dos inibidores de proteases Bdellastasina e Ghilantina da família das antistasinas
Data
2000
Autores
Lopes, Alexandre Paulo Yague 
Orientadores
Sampaio, Claudio Augusto Machado
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Sanguessugas e outros animais hematofagos tem sido descritos como fonte d diversas Proteinas com propriedades anticoagulantes. Algumas destas proteina fazem parte da familia Antistasina de inibidores de proteases. Ghilantina bdellastasina sao membros desta familia com atividade inibitoria sobre fator Xa plasmina, respectivamente. O primeiro objetivo deste trabalho foi concluido com o estabelecimento do sistema de expressao em Pichia pastoris da proteina bdellastasina. O exito obtido na expressao do inibidor demonstrou que o sistema poderia, em principio, ser usado na expressao de outras proteinas da familia. O sistema mostrou-se eficiente nao somente pelo bom nivel de expressao da proteina heterologa, mas tambem pela facilidade de purificacao. O estudo das relacoes estrutura-funcao que definem as especificidades das interacoes enzima-inibidor entre fator Xa e ghilantina foram alvo da segunda parte deste trabalho. Para tal, foram produzidos hibridos da bdellastasina substituindo-se regioes desta por outras da ghilantina, supostamente responsaveis pela interacao com O fator Xa, com a finalidade de produzir um inibidor de fator Xa. Foram construidos cinco hibridos bdellastasina-ghilantina baseados em dados de estrutura primaria e especificidade e posteriormente mais seis variantes baseados em dados da estrutura tridimensional dos inibidores antistasina e bdellastasina. A construcao destes ultimos teve como objetivo a Introdução na bdellastasina dos residuos da ghilantina responsaveis pela interacao com o exositio do fator Xa, alem de alterar a conformacao global da bdellastasina para permitir uma interacao adequada. A construcao dos mutantes foi feita por sintese de genes, cassete mutagenese e tecnicas de PCR e a expressao realizada em Pichia pastoris com subsequente purificacao e estudos funcionais. Os hibridos produzidos, com excecao dos mutantes SRY, mantiveram a capacidade e inibicao de tripsina, mas nao apresentaram nenhum efeito sobre o fator Xa. Considerando-se que grandes regioes foram substituidas, e razoavel pensar que a estrutura terciaria final dos hibridos apresente impedimento no ajusto perfeito da enzima com o inibidor. Na ultima parte deste trabalho foram estudadas as funcoes dos dominios isolados da ghilantina na atividade global do inibidor. Com este proposito os genes da ghilantina e de seus dominios isolados foram construidos e expressos em P. pastoris....(au)
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2000. 125 p. ilustab.