Padrão de glicosilação da glicoproteína do vírus da raiva produzida em células drosophila melanogaster S2: diferentes sistemas de expressão e condições de cultivo tese
Data
2019-11-13
Autores
Silva, Livia Pilatti Mendes Da 
Orientadores
Augusto, Elisabeth De Fatima Pires
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Rabies virus glycoprotein (RVGP) produced in animal cells had become an attractive alternative for development of a new vaccine against rabies with lower biosecurity risk and lower costs. In recombinant proteins production host cell lineage and cultivation parameters and conditions are important factors for glycoform profile of final protein, which impacts directly in its function. Objectives: Determine and compare the glycosylation pattern of rabies virus glycoprotein (RVGP) expressed in insect Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2), in different expression systems and culture conditions. Methods: S2 cells expressing RVGP in cell membrane using inducible (S2MtRVGP-imm) or constitutive (S2AcRVGP-2) promoter, and expressing the soluble RVGP ectodomain, using an inducible promoter (S2BipMt_RVGP-Ecto), stablished in previous studies, were used in the present work. S2BipMt_RVGP-Ecto cells were cultivated in schott flasks and S2MtRVGP-imm cells were cultivated in schott and spinner flasks, in both cases with different induction parameters and cultivation time. S2AcRVGP-2 cells grown in bioreactor, in batch or fed-batch with glutamine supplementation. An immunoaffinity chromatography methodology for membrane rRVGP (rRVGP-S2Mt and rRVGP-S2Ac) were stablished using a commercial monoclonal antibody attached to a HiTrap NHSactivated HP (GE). Soluble ectodomain (rRVGP-S2Ecto) were purified by Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC-Ni+2). Glycosylation pattern were analyzed by hydrophobic interaction chromatography (HILIC) or by HILIC accoupled with a mass spectrometry (UPLC-FLR-MS/MS). Results: For S2BipMt_RVGP-Ecto cells, the variation in inductor concentration presented biological effect that reflected on cell growth and rRVGP production. Inductor concentration and cell concentration at induction resulted in an increase in rRVGP production speed by S2MtRVGP-imm cells. Cultivation on spinner flasks results in a higher production of rRVGP-S2Mt comparing with schott flasks cultivation. The strategy of low initial glutamine concentration with supplementation during the S2AcRVGP-2 cell cultivation decreased the ammonium formation after the end of exponential phase, with an impact on growth and rRVGP production. Immunoaffinity chromatography methodology purification generated samples with high level of purity and efficiency up to 99 % of trimeric rRVGP-S2Mt. For rRVGP-S2Ac the same methodology worked with less efficiency and low level of purity. IMAC-Ni+2 used for rRVGP-S2Ecto presented low level of purity due to the low amount of expressed glycoprotein. In glycan pattern analyzes, samples of rRVGP-S2Ecto presented in higher proportion paucimannosidic structures: F(6)M2, M3 and F(6)M3. In rRVGP-S2Mt samples, the structures F(6)M2 e M3 were detected in higher proportion. rRVGP-S2Ac samples presented higher proportion of structures M2, F(6)M2 e M3. Conclusions: Increase of inductor concentration and of cell concentration at induction time results in a biological effect, by increasing expression speed of rRVGP. Specific production speed of rRVGP has a direct influence on decrease of N-glycans processing. Furthermore, different cultivation modes resulted in variation in glycan pattern, and a drastic reduction in initial glutamine concentration resulted in an increase on glycoforms with five or more mannose residues.
A glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) produzida em células animais tem se tornado uma alternativa atrativa para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a raiva com menor risco de biossegurança e menor custo. Na produção de proteínas recombinantes, a escolha da linhagem celular hospedeira e os parâmetros e condições de cultivo são fatores particularmente importantes para o perfil de glicoformas da proteína final, que impacta diretamente na função esperada da proteína. Objetivos: Determinar e comparar o padrão de glicosilação da proteína do vírus da raiva (RVGP) expressa em células de inseto Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2), em diferentes sistemas de expressão e condições de cultivo. Métodos: Foram utilizadas células S2 expressando a RVGP na membrana celular utilizando promotor induzível (S2MtRVGP-imm) ou constitutivo (S2AcRVGP-2) e expressando o ectodomínio da RVGP na forma solúvel, utilizando um promotor induzível (S2BipMt_RVGP-Ecto) estabelecidas em trabalhos anteriores. As células S2BipMt_RVGP-Ecto foram cultivadas em frasco schott, e as células S2MtRVGP-imm foram cultivadas em frascos schott e em spinner, em ambos os casos variando o tempo e a indução da expressão. As células S2AcRVGP-2 foram cultivadas em biorreator de bancada, em modo descontínuo ou descontínuo alimentado com suplementação de glutamina. Uma metodologia para purificação da rRVGP expressa na membrana celular (rRVGP-S2Mt e rRVGP-S2Ac) foi estabelecida por cromatografia de imunoafinidade utilizando um anticorpo monoclonal comercial ligado à coluna HiTrap NHS-activated HP (GE). O ectodomínio solúvel (rRVGP-S2Ecto) foi purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC-Ni+2). O padrão de glicosilação foi analisado por cromatográfica de interação hidrofóbica (HILIC) ou por cromatográfica do tipo HILIC associada a espectrometria de massas (UPLC-FLRMS/ MS). Resultados: Para as células S2BipMt_RVGP-Ecto, a variação na concentração de indutor apresentou efeito biológico que refletiu no crescimento e na produção da rRVGP. A concentração de indutor e a concentração de células na hora da indução resultaram em aumento da velocidade de produção da rRVGP por células S2MtRVGP-imm. O cultivo em frascos do tipo spinner resulta numa maior produção de rRVGP-S2Mt quando comparado com frascos do tipo schott. A estratégia de diminuição da concentração inicial de glutamina com suplementação durante o cultivo de células S2AcRVGP-2 reduziu a formação de amônio após o fim da exponencial, influenciando no crescimento e na produção de rRVGP. A metodologia de purificação por cromatografia de imunoafinidade gerou amostras com alto grau de pureza, com eficiência de até 99% em RVGP na forma trimérica para a rRVGP-S2Mt. Para a rRVGPS2Ac a mesma metodologia funcionou de maneira menos eficiente e com menor grau de pureza, devido a diferenças estruturais entre as duas proteínas. A IMAC-Ni+2, utilizada para rRVGP-S2Ecto, apresentou baixo índice de pureza possivelmente devido à baixa quantidade de glicoproteína expressa. Quanto as análises do padrão de glicosilação, as amostras rRVGP-S2Ecto apresentaram em maior proporção as estruturas paucimanosídicas F(6)M2, M3 e F(6)M3. Nas amostras rRVGP-S2Mt as estruturas F(6)M2 e M3 foram detectadas em maior proporção. As amostras rRVGP-S2Ac apresentaram maior proporção das estruturas M2, F(6)M2 e M3. Conclusões: O aumento das concentrações de indutor e de células no momento da indução apresenta efeito biológico, influenciando na velocidade de expressão de rRVGP. A velocidade específica de produção de rRVGP influencia diretamente na diminuição do processamento das N-glicanos. Além disso, os diferentes modos de cultivo utilizados resultaram em variação no padrão de glicosilação, sendo a que a diminuição drástica da glutamina inicial resultou num aumento de glicoformas com cinco ou mais resíduos de manose.
A glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) produzida em células animais tem se tornado uma alternativa atrativa para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a raiva com menor risco de biossegurança e menor custo. Na produção de proteínas recombinantes, a escolha da linhagem celular hospedeira e os parâmetros e condições de cultivo são fatores particularmente importantes para o perfil de glicoformas da proteína final, que impacta diretamente na função esperada da proteína. Objetivos: Determinar e comparar o padrão de glicosilação da proteína do vírus da raiva (RVGP) expressa em células de inseto Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2), em diferentes sistemas de expressão e condições de cultivo. Métodos: Foram utilizadas células S2 expressando a RVGP na membrana celular utilizando promotor induzível (S2MtRVGP-imm) ou constitutivo (S2AcRVGP-2) e expressando o ectodomínio da RVGP na forma solúvel, utilizando um promotor induzível (S2BipMt_RVGP-Ecto) estabelecidas em trabalhos anteriores. As células S2BipMt_RVGP-Ecto foram cultivadas em frasco schott, e as células S2MtRVGP-imm foram cultivadas em frascos schott e em spinner, em ambos os casos variando o tempo e a indução da expressão. As células S2AcRVGP-2 foram cultivadas em biorreator de bancada, em modo descontínuo ou descontínuo alimentado com suplementação de glutamina. Uma metodologia para purificação da rRVGP expressa na membrana celular (rRVGP-S2Mt e rRVGP-S2Ac) foi estabelecida por cromatografia de imunoafinidade utilizando um anticorpo monoclonal comercial ligado à coluna HiTrap NHS-activated HP (GE). O ectodomínio solúvel (rRVGP-S2Ecto) foi purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC-Ni+2). O padrão de glicosilação foi analisado por cromatográfica de interação hidrofóbica (HILIC) ou por cromatográfica do tipo HILIC associada a espectrometria de massas (UPLC-FLRMS/ MS). Resultados: Para as células S2BipMt_RVGP-Ecto, a variação na concentração de indutor apresentou efeito biológico que refletiu no crescimento e na produção da rRVGP. A concentração de indutor e a concentração de células na hora da indução resultaram em aumento da velocidade de produção da rRVGP por células S2MtRVGP-imm. O cultivo em frascos do tipo spinner resulta numa maior produção de rRVGP-S2Mt quando comparado com frascos do tipo schott. A estratégia de diminuição da concentração inicial de glutamina com suplementação durante o cultivo de células S2AcRVGP-2 reduziu a formação de amônio após o fim da exponencial, influenciando no crescimento e na produção de rRVGP. A metodologia de purificação por cromatografia de imunoafinidade gerou amostras com alto grau de pureza, com eficiência de até 99% em RVGP na forma trimérica para a rRVGP-S2Mt. Para a rRVGPS2Ac a mesma metodologia funcionou de maneira menos eficiente e com menor grau de pureza, devido a diferenças estruturais entre as duas proteínas. A IMAC-Ni+2, utilizada para rRVGP-S2Ecto, apresentou baixo índice de pureza possivelmente devido à baixa quantidade de glicoproteína expressa. Quanto as análises do padrão de glicosilação, as amostras rRVGP-S2Ecto apresentaram em maior proporção as estruturas paucimanosídicas F(6)M2, M3 e F(6)M3. Nas amostras rRVGP-S2Mt as estruturas F(6)M2 e M3 foram detectadas em maior proporção. As amostras rRVGP-S2Ac apresentaram maior proporção das estruturas M2, F(6)M2 e M3. Conclusões: O aumento das concentrações de indutor e de células no momento da indução apresenta efeito biológico, influenciando na velocidade de expressão de rRVGP. A velocidade específica de produção de rRVGP influencia diretamente na diminuição do processamento das N-glicanos. Além disso, os diferentes modos de cultivo utilizados resultaram em variação no padrão de glicosilação, sendo a que a diminuição drástica da glutamina inicial resultou num aumento de glicoformas com cinco ou mais resíduos de manose.