Caracterizacao do cultivo ex vivo de celulas epiteliais conjuntivais humanas sobre membrana amniotica
Data
2012
Autores
Silber, Paulo Caldas 
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Objetivo: Caracterizar as celulas obtidas atraves cultivo ex vivo por expansao epitelial de fragmento conjuntival humano sobre membrana amniotica. Metodos: Fragmentos de conjuntiva de 4 x 2 mm foram coletados do fornice conjuntival de nove doadores vivos, que foram submetidos a cirurgia de pterigio. Todos os doadores assinaram termo de consentimento de acordo com o Comite de Etica da UNIFESP/EPM antes do procedimento. Cada fragmento de conjuntiva foi levado ao laboratorio de superficie ocular. Em ambiente esteril, o tecido foi dividido em dois fragmentos: um foi cultivado sobre membrana amniotica desepitelizada; o outro, em placa de cultura. As culturas foram incubadas com DMEM/HAMÆs F12 a 37ºC e 5% de CO2. Os meios de cultura foram trocados a cada dois dias por tres semanas. Apos esse periodo, as culturas sobre as placas foram fixadas para analise imunocitoquimica com citoqueratinas epiteliais (CK3, CK19), marcadores de proliferacao (Ki-67), marcador para celulas indiferenciadas (p63) e marcador para celulas-tronco (ABCG2). Os mesmos marcadores foram utilizados nas culturas sobre as membranas com atraves de imunofluorescencia. Foram realizadas tambem citologia de impressao para coloracao com HE/PAS e microscopia eletronica de transmissao. Resultados: As celulas conjuntivais de nove biopsias expandiram-se com sucesso tanto na placa de cultura quanto sobre a membrana amniotica. O crescimento sobre a placa foi estatisticamente mais significativo que sobre a membrana amniotica a partir do 10° dia de cultura (p<0,01). A partir do 14° dia de cultura, essa diferenca tornou-se maior (p<0,001). A citologia de impressao mostrou epitelio cuboide compacto, entremeado por celulas caliciformes. A microscopia eletronica demonstrou a presenca de epitelio conjuntival estratificado, evidenciando microvilosidades nas celulas mais superficiais e celulas basais com sinais de intensa atividade metabolica. A analise imunocitoquimica mostrou positividade para os anticorpos para os antigenos Ki-67(66,01), CK3(53,56%), CK19(24,39%), p63(16,69%) e ABCG2(10,35%). Na imunofluorescencia a positividade foi expressiva para todos os marcadores testados. Conclusao: Os resultados demonstram que as celulas cultivadas pelo metodo da espansao epitelial ex vivo mostram um padrao fenotipico adequado para celulas conjuntivais, mostrando um tecido estratificado, diferenciado, mas com presenca de celulas primordiais. Esse metodo representa uma alternativa na terapeutica para muitas doencas de superficie ocular
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2012. 94 p.