Funcionalização De Nanopartículas Metálicas Com Diferentes Combinações De Peptídeos Para Aplicações Como Agentes Antimicrobianos E Antitumorais
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Date
2017-11-27
Authors
Formaggio, Daniela Maria Ducatti [UNIFESP]
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Tada, Dayane Batista [UNIFESP]
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Dissertação de mestrado
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Abstract
Metal nanoparticles (NPs) have showing promising applications in the biomedical field. These NPs have unique physicochemical properties, as well as great chemical versatility on their surface, which allows new modifications and incorporations of different molecules. In addition, they have the advantage of accumulating preferentially in tumor tissues due to the enhanced permeability and retention effect, known as EPR. The incorporation of therapeutic peptides to the surface of metallic NPs could be a promising strategy to improve their applications as therapeutic molecules. Peptides are highly selective molecules. However, they are also vulnerable to some in vivo pharmacologic barriers limiting their effective action, including low bioavailability or deactivation by enzymes. In this work, three types of metal NPs were prepared: gold NPs (AuNPs), silver NPs (AgNPs) and bimetallic NPs composed by gold and platinum (AuPtNPs). NPs were characterized by ultraviolet-visible spectroscopy (UV-Vis), dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM), inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES) and X-ray diffraction (XRD). Aiming at biomedical applications, NPs were firstly evaluated regarding their toxicity by cell viability assays using human fibroblast cells (HS68 cell line) and embryonic toxicity test in zebrafish (Danio rerio). The assays showed better biocompatibility of AuNPs compared to AgNPs and AuPtNPs. Thus, AuNPs were studied as carriers of antitumor and antimicrobial peptides as an alternative approach of overcoming the pharmacokinetic limitations inherent in these molecules. Two peptides derived from complementary monoclonal antibodies (CDRs) with amino acid sequences YISCYNGATSYNQKFK (C7H2) and RASQSVSSYLA (HuAL1) were previously identified by collaborators of this project demonstrating excellent toxicity against tumor cells, antimetastatic activity as well as a potent antimicrobial activity. The peptides were individually conjugated to the AuNPs surface, forming the AuNPsC7H2 and AuNPsHuAL1 NPs. The peptides were also linked together forming the AuNPsC7H2HuAL1. The in vitro results suggested an improved antitumor activity for AuNPsHuAL1 and AuNPsC7H2HuAL1 against metastatic melanoma tumor cell line (B16F10-Nex2) compared to the peptides in solution. In vivo, the peptide combination of HuAL1 and C7H2 was even more efficient when linked to AuNPs. The antimicrobial activity of the three NPs separately as well as the peptide functionalized AuNPs were also evaluated employing microdilution test against strains of Candida Albicans, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. The results confirm an intrinsic antimicrobial action of the three metal NPs and an optimal antibiotic action for AuNPsHuAL1.
As nanopartículas (NPs) metálicas têm sido amplamente aplicadas na área biomédica. Essas NPs apresentam características físico-química únicas, ótima versatilidade em sua síntese química e de superfície, além da vantagem de acumularem-se preferencialmente em tecidos tumorais devido ao efeito de permeabilidade e retenção aumentadas, conhecido como EPR (do inglês, Enhanced Permeability and retention). A incorporação de peptídeos terapêuticos à superfície de NPs metálicas é uma estratégia promissora para aprimorar as aplicações dessas moléculas na área da saúde. Os peptídeos são altamente seletivos, porém encontram diversas barreiras fisiológicas ao adentrar no organismo, relacionadas à baixa biodisponibilidade ou desativação por enzimas. Neste trabalho, foram preparadas três tipos de NPs metálicas, sendo elas, NPs de ouro (AuNPs), NPs de prata (AgNPs) e NPs bimetálicas de ouro e platina (AuPtNPs). As caracterizações físico-químicas dessas NPs foram realizada pelas técnicas de espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (MET), espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) e difração de raios-X (DRX). Visando aplicações biomédicas, as NPs foram analisadas quanto a sua toxicidade através de ensaios de viabilidade celular em células de fibroblasto humano (linhagem HS68) e de toxicidade embrionária em zebrafish (Danio rerio). Os ensaios evidenciaram a biocompatibilidade superior de AuNPs em relação às AgNPs e AuPtNPs. Assim, as AuNPs foram estudadas como sistemas de carreamento de peptídeos antitumorais e antimicrobianos, como forma de superar as limitações farmacocinéticas inerentes à essas moléculas. Dois peptídeos derivados de CDR’s (do inglês, complementary determining region) de anticorpos monoclonais, de sequências YISCYNGATSYNQKFK (C7H2) e RASQSVSSYLA (HuAL1), foram escolhidos para compor esses sistemas por terem exibido toxicidade contra células tumorais, atividade antimetastática, além de uma potente ação antimicrobiana. As AuNPs foram funcionalizadas com os peptídeos C7H2 e HuAL1. Esses peptídeos foram ligados às AuNPs individualmente, formando as NPs AuNPsC7H2 e AuNPsHuAL1 e também em conjunto formando as NPs AuNPsC7H2HuAL1. A atividade antitumoral das AuNPs funcionalizadas com os peptídeos foi demonstrada in vitro, em linhagem tumoral de melanoma metastático (B16F10-Nex2) e linhagem não-tumoral de fibroblasto humano (HS68), e também, in vivo, em camundongos do tipo C57BL/6 com melanoma metastático, como forma de avaliar sua capacidade terapêutica. Os resultados in vitro sugeriram um efeito antitumoral aprimorado para AuNPsHuAL1 e AuNPsC7H2HuAL1, comparadas com os peptídeos em suas formas livres. In vivo, a combinação peptídica dos peptídeos HuAL1 e C7H2 também foi mais eficiente quando ligada à AuNPs. A atividade antimicrobiana das NPs sem funcionalização e de AuNPs funcionalizadas também foi testada pelo método de microdiluição seriada frente à cepas de Candida Albicans, Pseudomonas Aeruginosa e Staphylococcus aureus. Os resultados comprovam a existência de uma ação antimicrobiana intrínseca às três NPs metálicas e uma ótima ação antibiótica para AuNPsHuAL
As nanopartículas (NPs) metálicas têm sido amplamente aplicadas na área biomédica. Essas NPs apresentam características físico-química únicas, ótima versatilidade em sua síntese química e de superfície, além da vantagem de acumularem-se preferencialmente em tecidos tumorais devido ao efeito de permeabilidade e retenção aumentadas, conhecido como EPR (do inglês, Enhanced Permeability and retention). A incorporação de peptídeos terapêuticos à superfície de NPs metálicas é uma estratégia promissora para aprimorar as aplicações dessas moléculas na área da saúde. Os peptídeos são altamente seletivos, porém encontram diversas barreiras fisiológicas ao adentrar no organismo, relacionadas à baixa biodisponibilidade ou desativação por enzimas. Neste trabalho, foram preparadas três tipos de NPs metálicas, sendo elas, NPs de ouro (AuNPs), NPs de prata (AgNPs) e NPs bimetálicas de ouro e platina (AuPtNPs). As caracterizações físico-químicas dessas NPs foram realizada pelas técnicas de espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (MET), espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) e difração de raios-X (DRX). Visando aplicações biomédicas, as NPs foram analisadas quanto a sua toxicidade através de ensaios de viabilidade celular em células de fibroblasto humano (linhagem HS68) e de toxicidade embrionária em zebrafish (Danio rerio). Os ensaios evidenciaram a biocompatibilidade superior de AuNPs em relação às AgNPs e AuPtNPs. Assim, as AuNPs foram estudadas como sistemas de carreamento de peptídeos antitumorais e antimicrobianos, como forma de superar as limitações farmacocinéticas inerentes à essas moléculas. Dois peptídeos derivados de CDR’s (do inglês, complementary determining region) de anticorpos monoclonais, de sequências YISCYNGATSYNQKFK (C7H2) e RASQSVSSYLA (HuAL1), foram escolhidos para compor esses sistemas por terem exibido toxicidade contra células tumorais, atividade antimetastática, além de uma potente ação antimicrobiana. As AuNPs foram funcionalizadas com os peptídeos C7H2 e HuAL1. Esses peptídeos foram ligados às AuNPs individualmente, formando as NPs AuNPsC7H2 e AuNPsHuAL1 e também em conjunto formando as NPs AuNPsC7H2HuAL1. A atividade antitumoral das AuNPs funcionalizadas com os peptídeos foi demonstrada in vitro, em linhagem tumoral de melanoma metastático (B16F10-Nex2) e linhagem não-tumoral de fibroblasto humano (HS68), e também, in vivo, em camundongos do tipo C57BL/6 com melanoma metastático, como forma de avaliar sua capacidade terapêutica. Os resultados in vitro sugeriram um efeito antitumoral aprimorado para AuNPsHuAL1 e AuNPsC7H2HuAL1, comparadas com os peptídeos em suas formas livres. In vivo, a combinação peptídica dos peptídeos HuAL1 e C7H2 também foi mais eficiente quando ligada à AuNPs. A atividade antimicrobiana das NPs sem funcionalização e de AuNPs funcionalizadas também foi testada pelo método de microdiluição seriada frente à cepas de Candida Albicans, Pseudomonas Aeruginosa e Staphylococcus aureus. Os resultados comprovam a existência de uma ação antimicrobiana intrínseca às três NPs metálicas e uma ótima ação antibiótica para AuNPsHuAL
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Keywords
Metal Nanoparticles, Silver Nanoparticles, Gold Nanoparticles, Bimetallic Nanoparticles, Aunps, Agnps, Auptnps, Therapeutic Peptides, Functionalization, Antitumor, Antimicrobial, Nanopartículas Metálicas, Nanopartículas De Prata, Nanopartículas De Ouro, Nanopartículas Bimetálicas, Aunps, Agnps, Auptnps, Peptídeos Terapêuticos, Funcionalização, Antitumoral, Antimicrobiano