Navegando por Palavras-chave "Vetores Genéticos"

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    Terapia genica de mucopolissacararidose tipo I com o sistema ΦC31 em modelo murino
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2011) Stilhano, Roberta Sessa [UNIFESP]
    A MPS I e uma doenca monogenica lisossomal causada por mutacoes no gene que codifica a enzima IDUA, requerendo fornecimento constante da enzima para aliviar a manifestacao da doenca. A reposicao enzimatica e o transplante de medula ossea sao opcoes terapeuticas disponiveis, mas alem dos problemas inerentes metodologicos e o alto custo dessas terapias, nao se observam melhoras na musculatura esqueletica, displasia ossea, deterioracao das valvulas cardiacas e degeneracao neurologica. O objetivo deste trabalho foi corrigir a defiCiência de expressao do gene IDUA nos camundongos KO atraves do sistema de expressao continua plasmideal com a integrase ΦC31 e o gene IDUA. Para avaliar a taxa de integracao e o tempo de expressao genica promovido pelo sistema ΦC31, o vetor pTA-GFP-attB, que expressa a proteina fluorescente verde GFP sob o controle do promotor CMV foi construido. A taxa de integracao em celulas HEK293 foi cerca de 10%. Para expressao da IDUA, tres vetores contendo a sequencia attB foram construidos: pVAX-attB-IDUA, uP-attB-IDUA e pattB-CAG-IDUA, que estao sob o controle do promotor CMV minimo, completo e CAG, respectivamente. Foi descoberta a atividade enhancer da sequencia attB no vetor pVAX-attB-IDUA, que promoveu cerca de 8X de aumento em relacao ao vetor pVAX-IDUA.Para transferencia do gene IDUA in vivo, 2,5 mL de solucao de vetor foi injetada rapidamente via veia caudal. Alto nivel de transfeccao foi confirmada com uso do vetor pSV-LacZ (expressa β-galactosidase) e tecidos corados com o substrato X-gal. Os camundongos selvagens (WT) transfectados com os vetores acima, que expressam IDUA, produziram mais de 1000 nmol/mL/h, apos 24 h. Entretanto, este nivel caiu rapidamente e, apos 28 dias, os niveis estavam proximos ao basal. Houve producao de anticorpo anti-IDUA humano, mas a resposta imune nao deve ter sido a responsavel pela queda, porque em um outro experimento em WT imunossuprimidos com ciclofosfamida, tambem foi observado o mesmo perfil de expressao da IDUA. Os animais KO pre-tratados com ciclofosfamida e injetados com pattB-CAG-IDUA apresentaram o mesmo perfil de queda da expressao que os WT tratados. Este resultado corrobora a ideia de que os anticorpos anti-IDUA nao devem ser responsaveis pela queda da expressao da IDUA. Apesar desta queda em menos de um mes, varios destes animais avaliados apos 4 meses de tratamento foram positivos para a atividade enzimatica e a queda de GAG nos tecidos. Estes mesmos animais mostraram melhora locomotora no teste de campo aberto. Este conjunto de resultados mostram que a alta producao de IDUA no inicio da transfeccao deve ser suficiente para baixar e manter os niveis de GAG estaveis por varios meses, e isto refletiu positivamente na melhora locomotora
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    Transferência do gene bsr [Gene de resistência a blasticidina-s] por meio de vetor retroviral: mutações na região do códon de iniciação levaram a superexpressão
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1997) Freitas, Antonio Carlos de [UNIFESP]; Han, Sang Won [UNIFESP]
    A Introdução de um DNA exogeno em uma celula de mamifero em cultura e a identificacao posterior das celulas transfectadas ou transduzidas, atraves de um marcador seletivo, e um passo fundamental nos protocolos de transferencia genica mediada por retrovirus. A blasticidina-S (BS) e um antibiotico nucleosidico produzido pela Streptomyces griseochromogenes, que inibe especificamente a sintese proteica, tanto em procariotos como em eucariotos. A acao inibitoria da BS pode ser controlada pela blasticidina-S desaminase (bsr), que converte a BS no derivado desaminohidroxila. O gene estrutural do bsr foi isolado do Bacillus cereus cepa K55-S1 e sua ORF e aproximadamente 420pb. Inicialmente, nos demonstramos por meio de vetores retrovirais construidos com o gene bsr (pLBSN e pLNSB),que as celulas transfectadas podem ser selecionadas em 8 dias utilizando 2µg/ml de BS. Ainda que este resultado seja comparavel ao resultado das celulas transfectadas com o gene neo e selecionadas com 500µg/ml de geneticina (G418), nos tentamos aumentar a expressao do gene bsr provocando mutacoes na regiao do codon de iniciacao. Desta forma, teriamos uma selecao rapida utilizando altas concentracoes de BS. Nosso objetivo principal era obter retrovirus recombinantes resistentes a BS para serem usados nos protocolos de terapia genica, porem, com os vetores construidos anteriormente, apenas poucos clones resistentes puderam ser observados. As mutacoes foram introduzidas no gene bsr atraves da tecnica PCR (terminal end PCR mutation technique) e o mutante denominado, bsr1. Os vetores LB1SN e LNSB1, que contem o gene bsr1 sob o controle do promotor e enhancer do retrovirus LTR ou do virus SV40, foram transfectados em celulas NIH3T3 e sua expressao analisada por Northern blot, atividade da enzima BS desaminase e ensaio de formacao de colonias. As celulas transfectadas com LB1SN tiveram que ser selecionadas com 4 ou 8µg/ml de BS contra 2µg/ml para LBSN e pSV2bsr, devido ao rapido crescimento das celulas resistentes. Esta alta resistencia tornou-se compreensivel, ao compararmos os niveis de mRNA transcrito e a atividade enzimatica. A atividade enzimatica aumentou cerca de 4 e 14 vezes comparando-se LB1SN com LBSN e pSV2bsr, respectivamente, sugerindo um maior efeito das mutacoes induzidas no processo de traducao. Quando estes vetores foram transduzidos em das celulas empacotadoras anfotropicas (PA317), somente LB1SN mostrou resistencia contra BS. Consequentemente, as outras linhagens foram selecionadas com geneticina. Os niveis de mRNA do bsr1 nos clones de PA317/LB1SN foram ligeiramente mais elevados do que os de bsr nos clones de PA317/LBSN, o que nao explica a alta resistencia do LB1SN em relacao ao LBSN. Alguns clones de PA317/LB1SN apresentaram alta atividade da BS desaminase (~6000U) e outros, ao redor de 1000U. Curiosamente, alguns clones das celulas selecionadas com geneticina (LBSN, LNSB e LNSB1) tambem mostraram alta atividade enzimatica. Porem, quando os clones celulares com mais de 1000U de atividade enzimatica foram incubados em meio com BS, somente as celulas derivadas de LB1SN cresceram normalmente, e as outras morreram em 5 dias. Deste modo, verificamos que a alta resistencia ao antibiotico BS promovida pelo mutante bsr1 comparado ao bsr, e principalmente ao aumento da biossintese da enzima blasticidina-S desaminase do que da transcricao genica
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    Transferência medida por vetores adenovirais do gene marcador lacZ para fibroblastos da conjuntiva e membrana de Tenon da região da bolha filtrante após esclerotomia em coelhos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1998) Skaf, Mirian [UNIFESP]; Mello, Paulo Augusto de Arruda [UNIFESP]
    Este estudo foi realizado para avaliar a possibilidade da transferencia genica mediada por vetores adenovirais para fibroblastos e celulas mesenquimais da regiao da bolha filtrante apos esclerostomia em coelhos. Utilizou-se o gene marcador lacZ e um vetor adenoviral contendo este gene introduzido nos olhos de 12 coelhos na propria bolha filtrante, no primeiro dia pos-operatorio. Os animais foram sacrificados no terceiro, setimo, decimo quarto e vigesimo primeiro dias pos-operatorios. Foram retirados blocos de tecido do local da cirurgia, e estes corados com solucao contendo X-gal, que confere as celulas positivas para o gene lacZ coloracao azulada. Algumas laminas com celulas positivas para o lacZ foram tambem corados para vimentina, por meio da tecnica de imunocitoquimica, para identificacao de fibroblastos. Os resultados demonstraram que apenas os blocos provenientes dos olhos submetidos a transinfeccao apresentaram coloracao azul. A microseccao apenas estes mesmos blocos apresentaram celulas azuis. Algumas das celulas positivas para o lacZ foram tambem positivas para vimentina, evidenciando a transinfeccao de fibroblastos e celulas mesenquimais. O numero de celulas lacZ positivas e o numero de celulas positivas para ambos (vimentina e lacZ) foram significantemente maiores no terceiro e setimo dias pos-operatorios (P< 0,01). Nao havia celulas azuis (lacZ positivas) no vigesimo primeiro dia pos-operatorio