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    Acesso aberto (Open Access)
    Desenvolvimento de modelo in vitro de superexpressão de ace2 e tmprss2 para estudo de infecção por Sars-Cov-2
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-01-27) Bartolomeo, Cynthia Silva [UNIFESP]; Prado, Carla Máximo [UNIFESP]; Stilhano, Roberta Sessa [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/2122125365795721; http://lattes.cnpq.br/1740478426977844; http://lattes.cnpq.br/9682597956704119; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2), agente etiológico da COVID-19 (Coronavirus disease 2019), tornou-se uma grande preocupação mundial, principalmente devido aos impactos nos sistemas de saúde na maioria dos países e na vida das pessoas. A entrada do vírus na célula hospedeira ocorre após a ligação da proteína spike (S), presente na espícula viral, ao receptor celular ACE2 (ECA2 - enzima conversora de angiotensina 2). Após a ligação, o vírus precisa ganhar acesso ao citosol, processo esse dependente da clivagem proteolítica da proteína S pela serino protease tipo II (TMPRSS2). No presente projeto, após avaliação da cinética viral nas linhagens Vero-E6, HuH7, BEAS-2B, A549, HEK-293T e HUVEC verificamos a existência de dois perfis de replicação viral. Nomeamos como “high-viral profile” as linhagens Vero-E6 e HuH7 por terem demonstrado uma capacidade de replicação viral ao longo do tempo muito superior às linhagens BEAS-2B, A549, HEK-293T e HUVEC que foram classificadas como sendo “low-viral profile”. Determinamos a expressão gênica e proteica dos receptores ACE2 e TMPRSS2 nas linhagens acima mencionadas, bem como a atividade de ACE2, de maneira a estabelecer uma relação aos achados da cinética viral. O desenvolvimento de um modelo que permita estudos relacionados à COVID-19 é de extrema relevância clínica, acadêmica e terapêutica. Assim sendo, a partir da criação de modelos celulares in vitro de superexpressão de ACE2 e TMPRSS2, em linhagens reconhecidamente suscetíveis ao SARS-CoV-2, visamos elucidar a participação desses receptores nos mecanismos fisiopatológicos da COVID-19. Foram desenvolvidos dois modelos de estudo in vitro do SARS-CoV-2: 1) modelo de superexpressão de ACE2 via plasmideal e 2) modelo de superexpressão de ACE2, TMPRSS2 e co-expressão de ACE2 e TMPRSS2 através de um vetor lentiviral em linhagens BEAS-2B, A549, HUVEC, HEK-293T e HuH7. Após criação do modelo de superexpressão via plasmideal das linhagens BEAS-2B-ACE2 e A549-ACE2 verificamos uma maior cinética de replicação viral quando comparadas aos seus respectivos controles, demonstrando que uma maior expressão do receptor ACE2 é capaz de promover uma potencialização na infecção por SARS-CoV-2. Constamos uma maior atividade de ACE2 nas linhagens acima mencionadas, como também na HUVEC-ACE2. Sendo a proliferação diminuída em todas as linhagens criadas (BEAS-2B-ACE2, A549-ACE2, HEK-293T e HUVEC-ACE2). Em células BEAS-2B e HUVEC, a superexpressão de ACE2 aumentou a cinética de replicação viral, em contrapartida a superexpressão de TMPRSS2 não promoveu maior entrada viral. Em relação à variante Ômicron, observamos uma cinética de replicação viral superior ao vírus selvagem em linhagem BEAS-2B-ACE2, uma cinética intermediária em linhagem BEAS-2B-ACE2-TMPRSS2 e inferior em BEAS-TMPRSS2. Ademais, foi possível verificar que a Ang II aumenta a replicação do SARS-CoV-2 WT em células HUVEC, sendo esse aumento suprimido quando o receptor ACE2 é superexpresso. Modelos in vitro que mimetizem a superexpressão de ACE2 e TMPRSS2, em diferentes tipos celulares, são de grande utilidade para o estudo dos mecanismos de infecção viral e desenvolvimento de terapias, podendo auxiliar em futuros estudos para verificação de uma possível potencialização da infecção, simulando a sensibilização das células após a entrada viral. Desta forma, um maior entendimento do papel da ACE2 e TMPRSS2 na COVID-19, poderá agregar conhecimentos de novos alvos terapêuticos, uma melhor compreensão dos mecanismos de entrada do vírus e o comportamento das células frente à infecção.
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    Acesso aberto (Open Access)
    SARS-CoV-2 infection and replication kinetics in different human cell types: The role of autophagy, cellular metabolism and ACE2 expression
    (Elsevier, 2022-09-06) Bartolomeo, Cynthia Silva [UNIFESP]; Lemes, Robertha Mariana Rodrigues [UNIFESP]; Morais, Rafael Leite Tavares de [UNIFESP]; Pereira, Gabriela Cruz [UNIFESP]; Nunes, Tamires Alves [UNIFESP]; Costa, Angelica Jardim [UNIFESP]; Maciel, Rui Monteiro de Barros [UNIFESP]; Braconi, Carla Torres [UNIFESP]; Maricato, Juliana Terzi [UNIFESP]; Janini, Luiz Mário Ramos [UNIFESP]; Okuda, Liria Hiromi; Lee, Kil Sun [UNIFESP]; Prado , Carla Máximo [UNIFESP]; Ureshino, Rodrigo Portes [UNIFESP]; Stilhano, Roberta Sessa; http://lattes.cnpq.br/1740478426977844; http://lattes.cnpq.br/9682597956704119; http://lattes.cnpq.br/5975254446394746; http://lattes.cnpq.br/1212794444821641; http://lattes.cnpq.br/2542981501423374; http://lattes.cnpq.br/8517445237869609; http://lattes.cnpq.br/1005025547870062; http://lattes.cnpq.br/3864261034300240; http://lattes.cnpq.br/6342740138292278; http://lattes.cnpq.br/8321096323728598; http://lattes.cnpq.br/5713863164263481; http://lattes.cnpq.br/4546671040397891; http://lattes.cnpq.br/7705881286363327; http://lattes.cnpq.br/1740478426977844; http://lattes.cnpq.br/7174742745591377; http://lattes.cnpq.br/2122125365795721; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Aims: This study evaluated SARS-CoV-2 replication in human cell lines derived from various tissues and inves­ tigated molecular mechanisms related to viral infection susceptibility and replication. Main methods: SARS-CoV-2 replication in BEAS-2B and A549 (respiratory tract), HEK-293 T (kidney), HuH7 (liver), SH-SY5Y (brain), MCF7 (breast), Huvec (endothelial) and Caco-2 (intestine) was evaluated by RT-qPCR. Concomitantly, expression levels of ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme) and TMPRSS2 were assessed through RT-qPCR and western blot. Proteins related to autophagy and mitochondrial metabolism were moni­tored in uninfected cells to characterize the cellular metabolism of each cell line. The effect of ACE2 over­ expression on viral replication in pulmonary cells was also investigated. Key findings: Our data show that HuH7, Caco-2 and MCF7 presented a higher viral load compared to the other cell lines. The increased susceptibility to SARS-CoV-2 infection seems to be associated not only with the differential levels of proteins intrinsically related to energetic metabolism, such as ATP synthase, citrate synthase, COX and NDUFS2 but also with the considerably higher TMPRSS2 mRNA expression. The two least susceptible cell types, BEAS-2B and A549, showed drastically increased SARS-CoV-2 replication capacity when ACE2 was overex­pressed. These modified cell lines are relevant for studying SARS-CoV-2 replication in vitro. Significance: Our data not only reinforce that TMPRSS2 expression and cellular energy metabolism are important molecular mechanisms for SARS-CoV-2 infection and replication, but also indicate that HuH7, MCF7 and Caco-2 are suitable models for mechanistic studies of COVID-19. Moreover, pulmonary cells overexpressing ACE2 can be used to understand mechanisms associated with SARS-CoV-2 replication.