Navegando por Palavras-chave "SERPING1"

Agora exibindo 1 - 2 de 2
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Angioedema Hereditário: desenvolvimento de um método de diagnóstico molecular baseado no gene SERPING1 e de um modelo celular in vitro da barreira hematoencefálica
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-12-19) Amorim, Priscila Nicolicht de [UNIFESP]; Porcionatto, Marimélia Aparecida [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESp]; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/6155537170968904; http://lattes.cnpq.br/2045104800186586
    Introdução: O angioedema hereditário é uma doença genética decorrente de variantes patogênicas no gene SERPING1, que codifica o inibidor de C1 esterase, cuja prevalência mundial estimada é de 1:50.000 a 1:100.000. A deficiência do inibidor de C1 esterase causa exacerbação das cascatas do complemento, fibrinolítica, da coagulação e das calicreínas-cininas e aumento da produção de mediadores inflamatórios, principalmente bradicinina, pela ação da enzima calicreína plasmática. O aumento de bradicinina ocasiona vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular levando ao extravasamento de fluído dos vasos para os tecidos, causando edema. O angioedema hereditário é caracterizado clinicamente por episódios recorrentes de edema local ou generalizado, além de oferecer risco de morte por asfixia. Apesar da generalização da ocorrência de edema, o sistema nervoso central parece ser um local protegido, pois os episódios de edema cerebral são raros ou inexistentes no angioedema hereditário. Com base nesse fenômeno, nossa hipótese é que as células endoteliais da microvasculatura cerebral expressem um inibidor da calicreína plasmática, impedindo a geração de bradicinina no local. Objetivos: Os objetivos desta tese foram i) desenvolver um método para detectar grandes deleções e inserções no gene SERPING1 para o diagnóstico de angioedema hereditário e, ii) estabelecer um protocolo simplificado com alto rendimento celular para o isolamento e purificação de células endoteliais da microvasculatura cerebral de camundongo neonato. Métodos: i) A Técnica de Quantificação de Éxons (TQE) foi desenvolvida utilizando o DNA total extraído de sangue de pacientes de duas famílias brasileiras com histórico clínico de angioedema hereditário, baixos níveis plasmáticos de C4 e C1-INH e nenhuma alteração patogênica em SERPING1 analisada por sequenciamento de Sanger; ii) Descrevemos um protocolo simplificado usando camundongos recém-nascidos C57BL/6 no dia pós-natal (P1) para isolar, purificar e cultivar monocamadas de células endoteliais da microvasculatura cerebral em dois substratos diferentes (lamínulas e insertos). Resultados: i) O uso da TQE permitiu detectar duas grandes deleções diferentes no éxon 4, uma de 1356 pb e outra de 1804 pb, que resultaram da recombinação de dois elementos Alu presentes nos íntrons 3 e 4 do gene SERPING1, ii) Testamos a função de células endoteliais da microvasculatura cerebral usando um modelo de privação de oxigênio-glicose. A caracterização e validação in vitro da cultura primária das células endoteliais incluiu microscopia de luz, imunomarcação e análise do perfil de expressão gênica. A medida da resistência elétrica transendotelial (TEER) foi usada como um ensaio funcional dos complexos de junção aderente. Conclusão: Com o desenvolvimento e utilização da técnica de quantificação de éxons foi possível estabelecer o diagnóstico molecular de duas famílias afetadas com o angioedema hereditário. Além disso, estabelecemos um modelo in vitro da barreira hematoencefálica que poderá ser utilizado para testar a hipótese da existência de um possível inibidor da calicreína plasmática expresso localmente nas células endoteliais da microvasculatura cerebral. A caracterização desse inibidor poderá ser um passo importante para o conhecimento e desenvolvimento de novas terapias para o tratamento do angioedema hereditário, para doenças neurológicas e neurodegenerativas.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Caracterização funcional de variantes genéticas ligadas ao Angioedema Hereditário
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-12-17) Marins, Maryana Mara [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESP]; Neves, Raquel Leão [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4426753884052758; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/1626371860783907
    Angioedema Hereditário (AEH) é uma doença genética rara não monogênica sendo os tipos I e II os mais prevalentes. Os tipos I e II tem como causa variantes genéticas patogênicas no gene SERPING1, o que resulta na deficiência quantitativa e ou funcional do inibidor C1 (C1-INH). A característica clínica clássica de ambos os tipos são crises de edema em diversos locais do corpo, com gravidade, duração e frequência variáveis, podendo ser letal. Objetivo: a caracterização de uma grande deleção, bem como o estudo funcional das variantes do tipo SNV p.G184R, p.A297T, p.A457P e p.A459D no gene SERPING1. Métodos: A caracterização da grande deleção foi realizada utilizando as técnicas de sequenciamento de Sanger, MLPA, TQE, dosagem de atividade sérica da C1 esterase, western blotting e estudo de segregação familiar. Para o estudo funcional das SNVs, plasmídeos contendo as variantes pontuais foram gerados por mutação sítio dirigida, clonados e transfectados na linhagem celular HepG2. Resultados: A caracterização da grande deleção mostrou que a mesma compreende aproximadamente 6.000pb, resultando na deleção completa dos éxons 5 e 6, que altera o quadro de leitura do SERPING1 e gera um códon de parada prematuro após 24 aminoácidos, denominada p.Asp229Glyfs*24. Essa variante é considerada patogênica e relacionada ao AEH do tipo I. Os mutantes das SNVs foram validados por sequenciamento de Sanger e após cultivo das células HepG2, a expressão dos C1-INHs mutantes foi avaliada por qPCR, western blotting e espectrofotometria (dosagem enzimática indireta do C1-INH). O estudo funcional das SNVs mostrou que as variantes p.G184R, p.A457P e p.A459D podem ser consideradas patogênicas. Com os testes realizados até o momento, ainda não se pode afirmar que a variante p.A297T, isoladamente, seja patogênica. Conclusão: Esse estudo destacou a importância da análise de variantes no gene SERPING1. Nossos achados identificaram variantes causadoras da doença, o que reforça que a incorporação de testes genéticos pode contribuir para avanços no aconselhamento genético, diagnóstico e tratamento do Angioedema Hereditário.