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    Avaliação do papel da endostatina imobilizada e regulação do NF-kB em células HK-2 submetidas à injúria por estresse oxidativo
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-08-31) Rocha Filho, Hugo Nobrega da [UNIFESP]; Bellini, Maria Helena [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4219112551635779; http://lattes.cnpq.br/2250447450293533; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A lesão renal aguda (LRA) é uma síndrome resultante da queda abrupta na taxa de filtração glomerular, acarretando profunda depleção de ATP intracelular. Tais alterações promovem a geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs), ativando mecanismos de estresse oxidativo e morte celular. As EROs participam da ativação do fator de transcrição nuclear NF-kB. A região NC1 do colágeno XVIII pode sofrer clivagem por proteases ou metaloproteinases e liberar endostatina (ES) e suas isoformas. Em alguns trabalhos anteriores nosso grupo demonstrou, in vitro, que uma das isoformas da ES imobilizada promoveu a sobrevivência de células endoteliais por meio do favorecimento da adesão celular. A partir de tais evidências, nosso objetivo foi avaliar o papel da ES imobilizada e a regulação do NF-kB em células HK-2 submetidas a injúria por estresse oxidativo. Desse forma, células HK-2 com (HK-2/ES) e sem ES (HK-2), foram injuriadas pela exposição ao Peróxido de Hidrogênio (H2O2) na concentração de 1mM por 2 horas e após 24 e 48 horas foram analisadas. Células HK-2 que não foram injuriadas foram nomeadas como grupo Controle. Avaliou-se o papel da ES imobilizada e a regulação do NF-kB através dos seguintes ensaios: Avaliação da viabilidade celular (ensaios de MTS e quantificação da enzima Lactato Desidrogenase - LDH), quantificação de EROs (citometria de fluxo com a sonda CM-H2DCFDA) e a expressão gênica do NF-kB através de PCR em tempo real e sua ligação ao DNA pelo ensaio do desvio da mobilidade eletroforética (EMSA). Nossos resultados evidenciaram que as células do grupo HK-2/ES apresentaram taxas de atividade mitocondrial/viabilidade celular de 49% (P < 0,001) após 24horas e de 25% (P < 0,001) após 48horas maiores em relação as HK-2. A quantificação de LDH revelou que após 24hs de injúria as células HK-2/ES apresentaram uma taxa de liberação de LDH 26% menor em relação as células foram injuriadas sem o prévio revestimento com ES. O resultados da quantificação de EROs corroboraram os achados dos ensaios anteriores. As células HK-2/ES apresentaram redução na produção de EROS de 35% em 24hs (HK-2 vs HK-2/ES P<0,005) e de 27% em 48hs (HK-2 vs HK-2/ES P<0,003). As células HK-2/ES apresentaram uma diminuição da transcrição das subunidades p-50 de 3,5 vezes (P < 0,001) e p65 de 3,4 vezes (P < 0,001) da via de sinalização do NF-?B. Os resultados do EMSA mostraram que o revestimento com ES acarretou uma diminuição da ativação do NF-KB. Assim nossos resultados indicam que a ES imobilizada minimiza a ativação do NFK-B após injúria por estresse oxidativo em células tubulares, refletindo no aumento da viabilidade celular.
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    Caracterização da regeneração, inflamação e estresse oxidativo no músculo de modelo experimental para distrofia muscular de Duchenne com fenótipo exacerbado pelo exercício
    (Universidade Federal de São Paulo, 2021-05-12) Lazzarin, Mariana Cruz [UNIFESP]; De Oliveira, Flavia [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3387760393535776; http://lattes.cnpq.br/1579497511371132; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introdução: A distrofia muscular de Duchenne é uma doença caracterizada por necrose muscular progressiva. O avanço das intervenções terapêuticas e das terapias genéticas tem trazido esperanças quanto à manutenção da funcionalidade motora mesmo em estágios mais tardios da doença. Entretanto, um grande desafio na prescrição de exercícios na reabilitação física para esses pacientes é a ausência de um perfil abrangente da resposta do músculo distrófico ao exercício. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi compreender, em camundongos mdx com fenótipo exacerbado pelo exercício, parâmetros relacionados à regeneração muscular, à inflamação e ao estresse oxidativo. Materiais e métodos: Camundongos C57BL/10 e C57BL/10-DMDmdx, com seis meses de vida, distribuídos em três grupos (n=10 cada): Controle, Mdx e Mdx+Exercício. O protocolo de corrida em declive foi de sete semanas, com frequência de cinco vezes na semana, a uma velocidade máxima particular para cada animal durante 60 minutos. Após eutanásia, o m. gastrocnêmio foi dissecado e realizou-se as análises: histopatológica; imunoistoquímica para marcadores de regeneração muscular (MyoD e Miogenina), de inflamação (COX-2) e para estresse oxidativo (8-OHdG); expressão de genes (qPCR) de NF-kB e NADP(H) Oxidase 2. Resultados: O grupo Mdx+Exercício apresentou a histopatologia do m. gastrocnêmio alterada pela corrida em declive, com maior incidência de fibrose endomisial e menor porcentagem de área de mionecrose. A análise imunoistoquímica revelou aumento da imunoexpressão de Miogenina no grupo Mdx+Exercício, mesmo não influenciando a expressão de MyoD; menor imunoexpressão do 8-OHdG no grupo Mdx e alterou a região histopatológica com imunoexpressão da COX-2. No grupo Mdx, a COX-2 estava relacionada com áreas de regeneração e infiltrado inflamatório, enquanto que no grupo Mdx+Exercício estava associado a regiões de fibrose muscular. Além disso, o exercício não influenciou a expressão gênica de NF-kB, porém aumentou o RNAm de NAD(P)H Oxidase 2. Conclusão: A exacerbação do fenótipo da DMD no músculo gastrocnêmio de camundongos mdx adultos está associada com o aumento da Miogenina, da COX-2 em regiões de fibrose e do 8-OHdG nuclear, bem como da expressão gênica de NAD(P)H Oxidase 2.
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    Engenharia de vetores expressando o receptor de TGFβ1 tipo II solúvel sob controle do promotor NF-kB e análise da expressão em culturas musculares 2D e 3D
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-07-24) Sales, Sofia Mila Cantu [UNIFESP]; Stilhano, Roberta Sessa; http://lattes.cnpq.br/2122125365795721; http://lattes.cnpq.br/7344894651433108
    Introdução: O TGF-β1 (Transforming growth factor beta 1) é um fator importante na cicatrização e formação de fibrose, cuja inibição é terapeuticamente relevante em lesões com perda muscular significativa. No presente trabalho, foi avaliada a funcionalidade do vetor lentiviral carreando o receptor solúvel de TGFβ (sTGFβRII) juntamente com o promotor induzível pelo NF-kB (fator de transcrição nuclear ligado na cadeia leve kappa das células B), que é altamente expresso durante a fase inflamatória da lesão muscular, em modelos de lesão 2D e 3D de células musculares. Objetivo: Desenvolvimento de vetores expressando o receptor de TGF-β1 tipo II solúvel sob o controle do promotor NF-kB e a avaliação da expressão em culturas musculares 2D e 3D. Metodologia: Células C2C12 foram transduzidas com vetores 1 (NFkb_Luciferase) ou 3 (NFkB_sTGβFRII). Essas linhagens produzidas foram cultivadas com meio DMEMc (Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM; 10% de soro fetal bovino (SFB); 1% Penicilina/estreptomicina (P/S)). Os esferoides de MDSC (muscle derived-stem cells) e C2C12 foram produzidos em micromoldes de agarose e cultivados com os meios de proliferação (PM) (Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM; 10% de soro fetal bovino (SFB); 10% de soro de cavalo (SC); 1% Penicilina/estreptomicina (P/S); 0,5% de extrato de embrião de galinha) e com o meio de diferenciação (DM) (DMEM; 10% SFB; 1% P/S). Foram produzidos também esferoides das linhagens 1 e 3. A caracterização dos esferoides foi realizada por diversos ensaios: viabilidade por citometria de fluxo (7AAD e Anexina V), CellTiter-Glo, live and dead (calceína e 7AAD) e MTT. Histologia em historresina com coloração de azul de toluidina, imuno-histoquímica e imunofluorescência para os marcadores MyoD, Pax7 e eMyHC e a criação do modelo de lesão com cloreto de bário (BaCl2) e cardiotoxina (CTX). Resultados: Nos ensaios 2D, observamos uma modulação da expressão gênica do sTGFβRII e luciferase na presença de BaCl2. Caracterizamos esferoides de MDSC e C2C12 com forma e tamanho homogêneos tanto no meio padrão de cultivo quanto no meio de DM. A viabilidade dos esferoides do grupo PM foi alta (88% no 2º dia e 74% no 14º dia), enquanto a viabilidade do grupo DM diminuiu para 44%, e a porcentagem de células apoptóticas aumentou para 56% no 14º dia. Na análise da morfologia, observamos um aumento de células fusiformes, especialmente no grupo DM, sugerindo a diferenciação. Também houve um aumento significativo na intensidade de fluorescência de eMyHC (7,5X), Pax-7 (2,1X) e MyoD (2X) em relação ao grupo PM no dia 14. O grupo PM mostrou uma capacidade de proliferação 5X maior que o grupo DM após o 4º dia, tanto em número total de células quanto nas células aderidas à placa. Os esferoides cultivados em meio PM também apresentaram uma maior capacidade de proliferação e fusão quando comparados ao meio DM. Nos esferoides C2C12, observamos um crescimento exponencial com um platô a partir do dia 14 em relação ao volume, e uma diminuição do volume do centro necrótico a partir do 4º dia. Na padronização do modelo de lesão por CTX e BaCl2, observamos uma redução na viabilidade dos esferoides em todos os grupos quando comparados ao controle (CTL) (p<0,05), exceto no grupo BaCl2 6,25%. As concentrações de BaCl2 de 50%, 12,5% e 6,25%, e CTX (1µM) apresentaram viabilidades de 27%, 53%, 74% e 24%, respectivamente. A lesão induzida com BaCl2 50% levou a uma redução de 60,5% do volume do esferoide (p<0,05) e 54% da viabilidade (p<0,05) em comparação com o grupo controle. Esferoides das linhagens 1 e 3 mostraram uma redução do tamanho dos esferoides da linhagem 3 (p<0,05), sugerindo a importância do TGF-β1 para a proliferação celular e a possibilidade de sua depleção do meio de cultura. Também observamos uma redução na viabilidade dos esferoides que superexpressaram o sTGFβRII (p<0,05). No modelo transwell, verificamos que o receptor solúvel foi expresso e teve um efeito nas células C2C12, reduzindo sua viabilidade frente à lesão com BaCl2. Conclusão: foi possível produzir e caracterizar esferoides de células musculares usando a técnica de micromoldes de agarose scaffold-free. Observamos que as células MDSC foram capazes de se diferenciar ao longo do tempo, apresentando maior expressão de marcadores miogênicos no meio DM. Além disso, desenvolvemos um modelo de lesão em esferoides de células C2C12 utilizando BaCl2 e CTX, o qual resultou em redução da viabilidade e alteração no volume dos esferoides. Demonstramos que o receptor solúvel foi expresso e modulado por BaCl2, no entanto, sua expressão levou a uma diminuição no tamanho e na viabilidade dos esferoides. Embora sejam necessários estudos adicionais para compreender o efeito do receptor solúvel na redução da fibrose, nosso estudo evidenciou sua funcionalidade e modulação na presença de agentes indutores de lesão muscular, como o BaCl2.
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    Estudo da regulação do NF-kB no carcinoma renal metastático após terapia gênica com endostatina
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-05-31) Braga, Marina de Souza [UNIFESP]; Marumo, Maria Helena Bellini [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4219112551635779; http://lattes.cnpq.br/1219776615768903; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O carcinoma de células renais (CCR) representa 3% dos tumores malignos humanos e, aproximadamente, 90% das neoplasias malignas renais. O subtipo mais frequente de CCR é o de células claras (CCRcc). A maioria dos pacientes possui mutação no gene supressor tumoral de von Hippel- Lindau (VHL) o que resulta em um aumento da transcrição de vários fatores angiogênicos. O fator de transcrição кB (NF-кB) compreende uma família de proteínas, sendo que no CCR, o aumento da atividade do NF-кB correlaciona-se com o aumento de marcadores de angiogenese, apoptose e também com o desenvolvimento e progressão. Em mamíferos são conhecidos cinco membros da família Rel/NF-кB: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-кB1 -p105/p50 e o NF- кB2-p100/p52. Na última década vários trabalhos foram publicados correlacionando a ativação do NF-кB no CCR com a angiogênese, resistência à quimioterapia e à apoptose. A endostatina (ES) é o produto da clivagem da porção carboxi-terminal do colágeno XVIII. In vitro, ela inibe a proliferação, migração e estimula a apoptose de células endoteliais. In vivo, a eficácia da ES no tratamento de diversos tipos tumorais tem sido demonstrada. A terapia gênica pode ser definida como a transferência de material genético visando o tratamento de patologias hereditárias ou adquiridas. Neste trabalho foi avaliado a modulação do NF-кB em células Renca-EGFP de pulmões metastáticos do modelo experimental singeneico ortotópico metastático, e as alterações nos parâmetros celulares em células Renca após o silenciamento do gene nf-kb1. Na primeira etapa desse trabalho avaliou-se a ativação do NF-кB no adenocarcinoma metastático com e sem tratamento antiangiogênico com ES. O tratamento com ES levou a uma baixa expressão dos genes bcl-3, nf-kb1 e c-Rel por PCR-RT array. Foi mostrado a ligação do NF-кB ao DNA em todas as amostras, entretanto nas células do grupo ES observou-se uma redução da atividade de ligação. Foi confirmado o deslocamento da subunidade p50 no grupo Controle. A subunidade p50 teve marcação citoplasmática expressiva e difusa bem como uma significativa marcação nuclear. Nos nódulos tumorais do grupo ES a subunidade p50 apresentou marcação citoplasmática e nuclear menos intensa. A expressão da Bcl-3 foi bastante evidente no núcleo e no citoplasma das células metastáticas dos animais do grupo controle e do grupo ES. A interação física entre a p50 e a Bcl-3 foi confirmada nos extratos nucleares das células dos pulmões metastáticos. Na segunda etapa do trabalho realizamos a avaliação de parâmetros celulares da p50 nas células Renca utilizando a técnica de RNA de interferência. Ao final da transfecção foi demonstrado a inibição da expressão dos níveis de p105/ p50, e evidenciado alterações na proliferação celular, diminuição do tempo de dobramento celular nas células Renca silenciadas em relação a Renca-Mock. A análise do ciclo celular revelou um aumento significativo de células Renca silenciadas nas fases G0/G1 em relação à célula Renca-Mock. As células Renca silenciadas apresentaram também expressão diminuída da ciclina D, umas das principais proteínas reguladoras das fases G0/G1. Nossos resultados confirmaram a presença do complexo p50/ Bcl-3 em extratos nucleares de células de tumor de pulmões metastático, sugerindo que a p50 juntamente com Bcl-3 desempenham um papel regulador na transcrição de genes em RCC; e com o silenciamento do gene nf-kb1, foi mostrado a participação da p50 nas vias de sinalização da proliferação das células Renca e indicando seu potencial como alvo para terapia antitumoral.
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    Mutações na via do NF-kB e sua interface com o CD40L na doença de Behçet: modelo in vitro para compreensão do fenótipo autoinflamatório
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-07-04) Aires, Patricia Pontes [UNIFESP]; Perazzio, Sandro Félix [UNIFESP]; Terreri, Maria Teresa; http://lattes.cnpq.br/6444207507484384; http://lattes.cnpq.br/7260269046007902
    Introdução: atualmente a doença de Behçet (DB) tem sido classificada dentro do grupo das síndromes autoinflamatórias poligênicas. Mutações pontuais isoladas nos genes TNFAIP3 e NEMO foram associadas a fenótipos similares à DB, chamando a atenção para a importância da via do NF-κB na patogênese da doença. Ademais, o sCD40L, presente em altas concentrações plasmáticas na DB, é capaz de induzir à explosão respiratória via PI3K/NF-κB. Entretanto, pouco se sabe sobre a influência das mutações citadas no sistema imunitário ou na sinalização mediada pelo sCD40L. Ainda, o impacto de mutações da via não canônica, incluindo o gene NFKB2, na interação com a via canônica e, potencialmente, na patogênese de doenças autoinflamatórias, ainda não foi plenamente elucidado. Objetivos: analisar o comportamento funcional das células HL-60, THP-1, Daudi e Jurkat, influenciado pela transfecção de componentes gênicos da via do NF-κB, na presença ou ausência de mutações pontuais, com enfoque na ativação pelo sCD40L. Métodos: células THP-1, HL-60, Daudi e Jurkat foram transfectadas com plasmídeos marcados com proteína fluorescente carreando os genes TNFAIP3, NEMO e NFKB2-p52 e suas respectivas variantes L227X, D406V e E418X. A influência da transfecção na expressão proteica dos componentes da via do NF-κB foi avaliada por citometria de fluxo. As linhagens celulares foram ainda avaliadas quanto às seguintes funções: capacidade proliferativa e resistência à indução de apoptose; capacidade fagocítica; metabolismo oxidativo; produção in vitro de TNF-, IL-1 e IL-6 e capacidade de formação de armadilhas extracelulares neutrofílicas (NET). Resultados: os resultados obtidos sugerem ser possível a determinação de um fenótipo celular específico para células portadoras de mutações na via do NF-kB, abrindo espaço para a avaliação funcional de pacientes com suspeita clínica de DB monogênica e outras patologias associadas à via do NF-kB. Em relação à transfecção da variante TNFAIP3 L227X, a expressão proteica de A20 foi reduzida em células THP-1 e HL-60, sugerindo um potencial efeito dominante-negativo da variante em fagócitos. A transfecção com a variante L227X levou a aumento da capacidade proliferativa, da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS, reactive oxygen species), da produção in vitro de IL-6 e da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NET, neutrophil extracellular traps). Células HL-60 transfectadas com TNFAIP3 L227X também apresentaram maior produção de IL-1β quando estimuladas com sCD40L. A capacidade fagocítica de células THP-1 foi reduzida após transfecção com TNFAIP3 L227X. A transfecção de NEMO D406V em células THP-1 levou à redução na capacidade proliferativa, resistência à apoptose e capacidade fagocítica; por outro lado, as células THP-1 transfectadas com NEMO D406V apresentaram maior produção de IL-6 e TNF-α. Células Jurkat transfectadas com NEMO D406V apresentaram maior capacidade proliferativa em estado basal, que não persistiu após estímulo; a resistência à apoptose foi menor. Células Daudi transfectadas com NEMO D406V apresentaram aumento da capacidade proliferativa e resistência à apoptose; a produção in vitro de IL-1β estava reduzida. As células HL-60 transfectadas com NEMO D406V apresentaram redução da fagocitose em estado basal, menor produção de ROS após estímulo e maior produção de NET. Em relação à transfecção de NFKB2-p52 E418X, as células THP-1 apresentaram redução na proliferação, resistência à apoptose, capacidade fagocítica e produção de ROS; a produção de IL-1β e IL-6 estava aumentada. Células Jurkat transfectadas com NFKB2-p52 E418X apresentaram menor resistência à apoptose e maior produção de IL-6, sob estímulo de sCD40L. Células Daudi transfectadas com NFKB2-p52 E418X apresentaram aumento na capacidade proliferativa, porém menor resistência à apoptose induzida por UV. Por fim, células HL-60 transfectadas com NFKB2-p52 E418X apresentaram redução na capacidade fagocítica e na produção de ROS e aumento na produção de NET após estímulo com sCD40L. Conclusões: o impacto das diferentes variantes varia de acordo com o tipo celular analisado, o que pode influenciar na diversidade de fenótipos encontrados em associação a cada mutação. A transfecção com TNFAIP3 L227X levou a uma redução na capacidade fagocítica e aumento na explosão respiratória de células THP-1, sugerindo que essa variante pode polarizar macrófagos para o subtipo M1. Além disso, a hiperprodução de IL-6 sugere a tendência a um fenótipo Th17, já previamente relatado na doença de Behçet, reforçando as semelhanças fisiopatológicas entre a haploinsuficiência de A20 e a DB. Já a transfecção com NEMO D406V induziu um fenótipo de exaustão parcial dos fagócitos, com comprometimento de funções celulares básicas, mas com aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias. Efeito similar foi visto nas células transfectadas com NKFB2-p52 E418X, que também tiveram comprometimento das funções e sobrevivência celular, com maior produção de citocinas pró-inflamatórias em relação às células não transfectadas.