Navegando por Palavras-chave "Inibidor Kunitz"

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    Construção de bibliotecas de inibidores de serinoproteases em sistema phage display: seleção de inibidores para enzimas de flavivírus e do mosquito Aedes Aegypti
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-02-09) Manzato, Verônica de Moraes [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; Torquato, Ricardo José Soares [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3995278540776284; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/3139881734780671
    Introdução: No Brasil, ocorrem, de forma endêmica, arboviroses como Dengue, Zika, Chikungunya e Febre amarela, que possuem um vetor comum, o mosquito Aedes aegypti. As enzimas NS2B-NS3 dos flavivírus e as tripsinas nos Aedes aegypti desempenham funções essenciais no ciclo viral e na digestão de Aedes spp, respectivamente, o que justifica a busca por inibidores dessas enzimas como opções para romper esses ciclos. Nesse contexto, a técnica phage display tem sido uma aliada. Os inibidores Boophilina domínio 1 (D1) e Sunflower trypsin inhibitor (SFTI), são representantes das famílias de inibidores Kunitz-BPTI (I2) e sunflower cyclic trypsin inhibitor (família I12), respectivamente, e inibem serinoproteases na ordem de nano molar. Objetivo: Selecionar através da técnica de phage display, inibidores das bibliotecas BoophilinaD1 e SFTI, com a utilização de 3 alvos (proteases ZIKV, DENV2 e tripsina5607). Seguido pela caracterização cinética e in silico dos mutantes mais frequentes. Métodos: As proteases DENV2Pro e tripsina5607, foram expressas em bactéria E coli SHuffleT7 e purificadas por afinidade. As bibliotecas de inibidores foram sintetizadas utilizando técnicas moleculares de PCR, incluindo o plasmídeo pCANTAB5E e bactérias E. coli TG1. As seleções foram realizadas para enzimas do vírus ZIKVPro, DENV2Pro e do mosquito vetor tripsina5607. Os mutantes de BoophilinaD1 mais frequentes, selecionados para a enzima do ZIKVPro foram produzidos e utilizados nos ensaios cinéticos para determinação do perfil inibitório para as enzimas (ZIKVPro e DENV2Pro), utilizados também na modelagem, docking molecular e refinamento para as enzimas de flavivírus, via MODELLER, ClusPro e RosettaDock, respectivamente. Resultados: As enzimas alvo purificadas apresentaram bandas predominantes e ativas em torno de 28 e 26 kDa, para DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. A ZIKVPro usada nas seleções foi gentilmente cedida por Dr. Martin Wurtele. Os títulos das bibliotecas utilizadas nos processos de seleção foram de 2,9 x 106 CFU e 2,1 x 105 CFU para BoophilinaD1 e SFTI, respectivamente. Dentre os inibidores BophD1 mut selecionados, 76,5% apresentam aminoácido básico Arg ou Lys na posição P1 e 70,6% e 58,8% Ala na posição P1’e P4’, respectivamente. O inibidor BoophD1 WT e os BoophD1 mut12 e mut14 apresentam Ki entre 1 e 2 nM para tripsina bovina e aproximadamente 100 e 300 nM para as enzimas ZIKVPro e DENV2Pro, respectivamente. As análises in silico de docking molecular indicam diferenças de interação dos mutantes com as enzimas. Os mutantes da biblioteca SFTI selecionados para os três alvos são, em sua maioria, compartilhados e sem consenso. Subtraindo-se os ligantes inespecíficos, destaca-se as sequências (P1-P4’) ARQLL, KSQWD e LSRHP por serem representativas para ZIKVPro, DENV2Pro e tripsina5607, respectivamente. Esses SFTIs mutantes foram sintetizados e serão utilizados futuramente nos ensaios cinéticos para caracterização inibitória com diferentes alvos. Discussão: As enzimas proteolíticas desempenham papéis importantes em diversas funções, no caso das DENV2Pro e ZIKVPro, estão relacionadas com a clivagem da poliproteína e no caso da tripsina5607, relacionada a digestão de proteínas ingeridas pela larva de Ae. aegypti. Obtê-las de forma recombinante, solúvel e ativa é importante para aprofundar nossos conhecimentos sobre elas e fornecem informações para o desenvolvimento de inibidores com alta afinidade, podendo ser um inibidor específico ou pan-inibidores (para diferentes flavivírus). Conclusão: Este trabalho traz dados importantes sobre a busca de inibidores para as proteases de flavivírus e de mosquito utilizando bibliotecas de inibidores em sistema phage display. Inibidores para ZIKVPro foram selecionados por phage display e apresentaram constantes de inibição em 10-7 M assim como para a DENV2Pro, estes resultados sugerem que os inibidores selecionados são candidatos a pan-inibidores para proteases de flavivírus.