Navegando por Palavras-chave "Hibridização in situ fluorescente"
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- ItemEmbargoAvaliação de pacientes com o espectro clínico da síndrome da deleção 22q11.2 através de hibridização in situ por fluorescência e da técnica multiplex ligation-dependent probe amplification(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-04-28) Pacanaro, Ade Nubia Xavier [UNIFESP]; Moraes-Pinto, Maria Isabel de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Introduction: The 22q11.2 deletion is the most frequent human microdeletion syndrome. The phenotype is highly variable and characterized by conotruncal heart defects, facial dysmorphism, velophalangeal dysfunction, hypoparathyroidism, thymic hypoplasia, learning disabilities, and mental retardation. Purpose: To investigate patients with clinical phenotype of the 22q11.2 deletion syndrome considering the presence, origin and extension of the deletion. To investigate other genomic region unbalances related to the syndrome. To correlate the different segments deleted with the phenotype. Methods: We studied 70 patients with diagnostic hypothesis of 22q11.2 deletion syndrome. Cytogenetic analysis was performed using G-banding. We used FISH (fluorescence in situ hybridization) technique in order to evaluate the deletion presence and origin, and MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) technique in order to identify deletions and to determine their sizes and also, to evaluate other chromosomal region unbalances. Results: The cytogenetic analysis using G-banding showed normal karyotypes in all patients, except in one that was 48,XXXX. We found 21 patients with deletion and 49 patients with normal results, using the FISH and MLPA approaches. Among the 18 deletions investigated with MLPA, 13 were 3 Mb deletion (72%), two were 1,5 Mb deletion (11%) and three were atypical deletions (17%). Two were inherited deletions. Conclusions: Among patients with the phenotype of 22q11.2 deletion syndrome, we found 30% cases of 22q11.2 deletion. The phenotype correlation with the different size deletions is not well established considering the wide phenotypic variation found either in patient with typical deletions of 3 Mb or in patients with smaller and atypical deletions. The frequency of phenotypic features did not differ significantly between deleted and not deleted patients’ groups. Considering the great phenotypic variability among patients with different deletions and the clinical characteristics overlapping with the ones present in not deleted patients, it is important molecular approaches for the diagnosis. FISH and MLPA approaches have proved successful in the investigation of 22q11.2 deletion, although only MLPA technique is able to determine the 22q11.2 deletion extension.
- ItemSomente MetadadadosCorrelação entre quimerismo hematopoético e doença residual mínima em pacientes portadores de leucemia mielóide crônica submetidos à transplante alogênico de médula óssea, através da análise comparativa do VNTR, FISH e RT-PCR multiplex(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2001) Gonsalez, Denize [UNIFESP]; Oliveira, José Salvador Rodrigues de [UNIFESP]OBJETIVO: Identificaçao de quimerismo hematopoético após transplante de, medula óssea alogênico em pacientes portadores de leucemia mielóide, crônica, e compará-lo à avaliaçao de doença residual mínima detectada pela análise molecular do rearranjo gênico bcr-abl MÉTODO: Foram avaliados 29 pacientes em duas fases distintas do TMO e, seus respectivos doadores em relaçao ao quimerismo hematopoético através da análise do VNTR pela técnica de PCR através dos primers APO-, B e D1 S80. A observaçao da fusao gênica bcr-abl foi realizada na fase final deste estudo por dois métodos. O primeiro, RT-PCR Multiplex, utilizou os, primers BCR (b2), BCR (rev) e ABL (a3). O segundo, FISH, que utilizou a sonda de thibridizaçao bcr-abl, detectou o rearranjo bcr-abl através da, observaçao em microscópio de fluorescência. O padrao ouro foi definido como a recaída hematológica. RESULTADOS: A comparaçao dos VNTR dos doadores e pacientes nas duas fases pré-estabelecidas mostrou que houve tendência à significância na comparaçao do quimerismo misto do D1 S80 com o padrao ouro e significância com a recaída molecular avaliada pelo FISH e RT-PCR Multiplex. A análise do primer APO-B nao mostrou significância quando comparada ao D1 S80, FISH, RT-PCR Multiplex ou padrao ouro. Quando o FISH e o RT-PCR Multiplex foram comparados com o padrao ouro, a concordância foi de 78,2 por cento e 44,2 por cento, respectivamente. A concordância entre ambos foi de 61 por cento...(au).
- ItemSomente MetadadadosEstudo genético-clínico e citogénetico molecular de um rearranjo complexo raro em mosaico com monossomia parcial 9p23-->pter E trissomia parcial 1q41-->qter(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2005) Kulikowski, Leslie Domenici [UNIFESP]; Melaragno, Maria Isabel [UNIFESP]Objetivos: Estudo genético-clínico e citogenético molecular de um caso raro de aberração cromossômica estrutural complexa em mosaico, com duas linhagens celulares aparentemente complementares. A paciente com a aberração cromossômica apresenta retardo de desenvolvimento neuropsicomotor e dismorfias faciais. O resultado do cariótipo foi inicialmente dado como sendo: 46,XX,dei(9)(p22)/46,XX,dup(9)(p22p24). Métodos: Avaliação da paciente e caracterização molecular da aberração cromossômica com delineação dos pontos de quebra envolvidos utilizando hibridação in situ por fluorescência (FISH) com diferentes tipos de sondas de cromossomos artificiais de bactérias (BACs) e os dados do Projeto Genoma Humano. Resultados: As hibridações com as sondas RP11-549112 e RP11-284P20 revelaram o ponto de quebra em 9p23, resultando em uma perda de material cromossômico de aproximadamente 13,9 Mb no cromossomo 9 deletado. O material adicional presente em 9p em uma das linhagens celulares não era proveniente do cromossomo 9. O bandamento de alta resolução e as hibridações com as sondas RP11-55F10 e RP11-11 H1 caracterizaram o material duplicado como sendo proveniente do cromossomo 1, abrangendo uma região de aproximadamente 35 MB, de 1q41 a 1qter. Após a avaliação por diferentes técnicas de citogenética molecular, o cariótipo foi finalmente estabelecido como sendo: 46,XX,del(9)(p23)[54]/46,XX,der(9)t(1;9)(q41;p23)[46], indicando que a paciente apresenta monossomia 9p23->pter em todas as suas células e trissomia 1q41->qter em cerca de metade de suas células. Conclusão: A paciente apresenta algumas manifestações clínicas descritas como para a monossomia 9p, Por outro lado, o quadro fenotípico também pode ser considerado semelhante ao da duplicação 1q, pois a maioria das alterações clínicas presentes na paciente é descrita tanto para a monossomia 9p quanto para a trissomia 1q. Nosso estudo sugere que o rearranjo complexo apresentado pela paciente pode ter se originado na meiose paterna ou materna por meio de um evento de translocação t(1;9)(q41;p23), provavelmente na primeira divisão mitótica e originando duas linhagens celulares diferentes, uma com uma deleção 9p23-->pter, e outra com a deleção associada com uma duplicação 1q41->qter. A estabilidade do cromossomo 9 deletado em uma das linhagens é devido possivelmente à formação de um neotelômero. A literatura mostra que seqüências teloméricas intersticiais (ITs) estão presentes no braço longo do cromossomo 1, em 1q41. Sugerimos que por um mecanismo de captura de telômero no ponto de quebra, um neotelômero possa ter sido formado. O presente estudo ressalta a importância do delineamento de rearranjos complexos combinando a análise por alta resolução e FISH com BACs para a compreensão da relação genótipo-fenótipo e dos possíveis mecanismos envolvidos na produção de aberrações cromossômicas.
- ItemSomente MetadadadosInvestigação citogenética molecular e clínica em pacientes com duplicação 1q e deleção 18q e estabelecimento de linhagens linfoblastóides(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2008) Kulikowski, Leslie Domenici [UNIFESP]; Melaragno, Maria Isabel [UNIFESP]Introduction: 0 aprimoramento da citogenética clássica com a introdução de técnicas moleculares, como a hibridação in situ por fluorescência (FISH) e a hibrldação genômica comparativa baseada em microarranjos de DNA (array-CGH) representou um grande avanço no estudo cromossômico. Esses métodos facilitaram a identificação de anormalidades citogenéticas e possibilitaram 0 estudo mais aprofundado de casos de aberrações cromossôomicas. Objetivos: Reavaliar por citogenética molecular dois pacientes portadores de duplicação 1 q e dez pacientes portadores da deleção parcial 18q previamente diagnosticados por bandamento G. Estabelecer Iinhagens linfoblastóides de portadores de anormalidades. Metodos: Investigação molecular por meio da técnica de FISH e, em um paciente, por meio da técnica de array-CGH. Resultados: Os resultados obtidos por FISH mostraram que ambas as duplicaçõs 1 q estudadas tem 0 ponto de quebra em 1 q41 sendo que um dos pacientes apresenta uma duplicação pura, rara na literatura. Revelaram também que os dez pacientes portadores da deleção 18q apresentam três pontos de quebra diferentes em 18q, mostrando perdas genômicas que variam de 11,1 Mb a 21,7 Mb. Todas as deleções 18q incluem a região subtelomérica sendo, portanto, terminais. Para um dos pacientes, a array-CGH confirmou a deleção terminal, refinou 0 ponto de quebra molecular e revelou que não há outras anormalidades genômicas associadas a deleção 18q. Foi possível estabelecer Iinhagens Iinfoblastóides de portadores de rearranjos cromossômicos não balanceados e realizar a sua criopreservação. Conclusão: As novas técnicas citogenéticas aliadas a métodos de preservação do material celular podem proporcionar um melhor entendimento dos mecanismos que desencadeiam as anormalidades cromossômicas..
- ItemAcesso aberto (Open Access)Organização espacial da transcrição como um potencial mecanismo de expressão gênica em Plasmodium falciparum(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009) Moraes, Carolina Borsoi [UNIFESP]; Silveira, Jose Franco da [UNIFESP]Crescentes evidências mostram que a organização espacial da transcrição é um fator epigenético importante na regulação gênica em eucariotos. Em células de mamíferos, os genes são transcritos em estruturas nucleares discretas conhecidas como fábricas de transcrição, e genes com funções relacionadas e co-regulados compartilham as mesmas fábricas de transcrição. Plasmodium falciparum apresenta um padrão de expressão gênica bastante complexo durante o ciclo eritrocítico, contrastando paradoxalmente com o baixo número de putativos fatores de transcrição codificados pelo seu genoma. Por outro lado, mecanismos epigenéticos são importantes na regulação gênica neste parasita. Nesta tese, investigamos a organização da transcrição em P. falciparum visando determinar se a organização nuclear está relacionada com a expressão/regulação gênica ao longo do desenvolvimento do parasita. Com este objetivo, marcamos transcritos nascentes com BrUTP em formas eritrocíticas de P. falciparum. Assim como em mamíferos, a transcrição no parasita também está organizada em focos nucleoplásmicos discretos, chamados fábricas de transcrição. Análises automatizadas de imagens em 3D mostram que o número e a intensidade das fábricas de transcrição variam durante o ciclo eritrocítico, estando correlacionados com o número de genes expressos em cada estágio, mas não com o volume nuclear. O baixo número de fábricas indica que os genes ativos compartilham as fábricas enquanto estão sendo transcritos. Surpreendentemente, as fábricas são espacilamente redistribuídas durante o desenvolvimento de anéis para trofozoítas, com a periferia nuclear sendo a zona de transcrição favorita nos anéis, enquanto nos trofozoítas as fábricas estão igualmente distribuídas por todo o nucleoplasma. Também observamos que a transcrição por RNA polimerase I ocorre principalmente nas áreas centrais dos núcleos em trofozoítas, sugerindo que os componentes nucleolares podem ser dispersos devido à entrada na fase S. Assim como nos eucariotos superiores, as fábricas de transcrição em P. falciparum também se localizam em áreas nucleares com baixa densidade de cromatina. Análises de imunofluorescência combinando incorporação de BrUTP com marcadores nucleares mostram que as fábricas de transcrição formam um compartimento exclusivo, diferente do compartimento de silenciamento definido por PfSir2A ou do compartimento de cromatina ativa definido por H4ac ou H3K79me3. Para estudar a organização espacial da cromatina e entender como os genes co-regulados interagem com as fábricas de transcrição, decidimos realizar ensaios de hibridização fluorescente in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH). Durante a realização de ensaios de FISH seguindo protocolos publicados, observamos uma grande variação na morfologia nuclear dos parasitas, o que nos moveu a otimizar esta técnica. Utilizando análises automatizadas de imagens, mostramos que os parasitas desidratados por secagem ao ar e fixados por curtos períodos de tempo à temperatura ambiente apresentam uma variação intra-populacional maior em relação à forma e ao volume nucleares após o ensaio de FISH, assim como valores de volume quase duas vezes maiores, do que núcleos de parasitas fixados em suspensão por longos períodos de tempo e em baixas temperaturas. Também observamos que a fixação em suspensão leva a uma melhor conservação da estrutura nuclear, e índices de colocalização mais altos para duas sondas de repetições adjacentes das extremidades cromossômicas, Rep20 e telômeros. Em resumo, nossos resultados mostram que o tipo de protocolo de fixação utilizado antes da realização do desenvolvimento de FISH é um fator crucial para a conservação apropriada da arquitetura nuclear.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Prevalence of chimerism after non-myeloablative hematopoietic stem cell transplantation(Associação Paulista de Medicina - APM, 2009-09-01) Ruiz, Azulamara da Silva [UNIFESP]; Chauffaille, Maria de Lourdes Lopes Ferrari [UNIFESP]; Alves, Solivanda Trindade; Oliveira, José Salvador Rodrigues de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Hospital Santa Marcelina Division of Hematology and Transfusion MedicineCONTEXT AND OBJECTIVE: Non-myeloablative hematopoietic stem cell transplantation (NMA-HSCT) is performed in onco-hematological patients who cannot tolerate ablative conditioning because of older age or comorbidities. This approach does not completely eliminate host cells and initially results in mixed chimerism. Long-term persistence of mixed chimerism results in graft rejection and relapse. Involvement of graft-versus-host disease is concomitant with complete chimerism and graft-versus-tumor effect. The aim of this study was to evaluate the prevalence of chimerism in onco-hematological patients who underwent NMA-HSCT. DESIGN AND SETTING: Observational clinical study on chimerism status after human leukocyte antigen-identical NMA-HSCT at the Discipline of Hematology and Hemotherapy of Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). METHODS: We sequentially analyzed the amplification of APO-B, D1S80, DxS52, FVW, 33.6, YNZ-2 and H-ras primers using variable number of tandem repeats (VNTR) on 17 pairs and fluorescent in situ hybridization (FISH) with the XY probe and SRY primer on 13 sex-unmatched pairs. RESULTS: The informativeness of the primers using VNTR was 60% for APO-B, 75% D1S80, 36% DxS52, 14% FVW, 40% YNZ-22 and 16% H-ras. The SRY primer was informative in female receptors with male donors. The XY-FISH method was informative in 100% of the sex-unmatched pairs. CONCLUSION: These methods were sensitive and informative. In VNTR, the association of APO-B with D1S80 showed 88% informativeness. The quantitative FISH method was more sensitive, but had the disadvantage of only being used for sex-unmatched pairs.