Navegando por Palavras-chave "GUVs"

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    Acesso aberto (Open Access)
    Eletroporação e estabilidade de membranas aniônicas com diferentes níveis de complexidade
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-07-19) Leomil, Fernanda dos Santos Costa [UNIFESP]; Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]; Dimova, Rumiana; http://lattes.cnpq.br/6408828276550407; http://lattes.cnpq.br/9178927522709552; http://lattes.cnpq.br/4382156853241028
    A estabilidade das membranas celulares é de importância vital para as células. Após estímulos de alta intensidade, como os causados pela aplicação de pulsos elétricos, poros são abertos na membrana (eletroporação) e se fecham em poucos ms, permitindo que a integridade da membrana seja preservada, conforme observado em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) neutras de PC (fosfatidilcolina). No entanto, a adição do lipídio negativo PG (fosfatidilglicerol) mostrou desempenhar um papel importante na desestabilização das membranas após eletroporação: (i) alguns poros se abrem indefinidamente, levando à completa perda da integridade da vesícula (bursting) e (ii) GUVs que sobreviveram à poração exibem permeabilidade de longa duração, revelando a permanência de poros submicroscópicos após o fechamento dos macroporos. Nesta tese, foi investigada a resposta mecânica de GUVs a campos elétricos, com foco na estabilidade de membranas contendo frações crescentes de lipídios aniônicos de conhecida relevância biológica, como o fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2), cardiolipina (CL), fosfatigilglicerol (PG) e extrato lipídico de E. coli, bem como foi examinada a relevância da assimetria dos lipídios negativos entre as monocamadas na estabilidade dessas membranas. Também foram explorados sistemas mais complexos, como vesículas gigantes de membrana plasmática (GPMVs), que representam um passo intermediário entre GUVs lipídicas e células, apresentando as características lipídicas e proteicas das células que as originaram. Métodos experimentais e computacionais foram desenvolvidos e aperfeiçoados ao longo do trabalho para a realização e análise dos experimentos executados. Em GUVs com distribuição simétrica de lipídios aniônicos, medidas da ocorrência de eventos desestabilizantes, como bursting e permeabilidade duradoura, mostraram que as membranas contendo frações mais altas de lipídios negativos (50 mol%) são mais instáveis e propensas à desestabilização. Esses efeitos, que se mostraram independentes do tipo de lipídio negativo utilizado, foram relacionados a uma redução de cerca de 50% na tensão de linha do poro, propriedade que governa o seu fechamento e que foi calculada através de um software desenvolvido durante o projeto (PoET). GUVs com distribuição assimétrica de lipídio negativo entre as monocamadas da membrana foram obtidas por dois métodos diferentes: transferência de fase e alterações do pH do meio externo das vesículas. A assimetria foi verificada por meio de um ensaio de supressão de fluorescência aperfeiçoado ao longo do estudo, em combinação com um algoritmo desenvolvido para medidas de fluorescência em GUVs. Eventos desestabilizantes foram observados já para pequenos graus de assimetria de carga (5 mol%), que potencializam a ocorrência de eventos mais extremos, como o bursting, devido à geração de curvatura espontânea acentuada. Quando consideramos modelos ainda mais relevantes, resultados preliminares mostram que existem diferenças na forma com que GPMVs e GUVs respondem a pulsos elétricos, provavelmente devido à maior complexidade exibida pelas membranas das GPMVs. Os resultados apresentados aqui evidenciam que os lipídios aniônicos possuem um papel importante na desestabilização das membranas após eletroporação, sendo os efeitos realçados no caso em que estes estão assimetricamente distribuídos entre as monocamadas das membranas, como observado nas membranas celulares. Acreditamos que os achados possam contribuir para o desenvolvimento de sistemas de entrega intracelular de drogas baseados em eletroporação mais eficientes. Ainda, julgamos que o aperfeiçoamento do ensaio de supressão de fluorescência e o desenvolvimento do software para cálculo da tensão de linha e do algoritmo para medidas de fluorescência serão de grande contribuição para a comunidade científica, permitindo a realização de experimentos e obtenção de dados de forma mais confiável e reprodutível.
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    Estudos comparativos do mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2012) Martins, Marta Natividade Crizol [UNIFESP]; Miranda, Antonio [UNIFESP]
    Os peptideos antimicrobianos (PAMs) sao componentes importantes do sistema de defesa inato de plantas e animais contra micro-organismos, bacterias e fungos. A maioria dos PAMs sao cationicos e anfipaticos, caracteristicas que sao essenciais para a sua interacao nao especifica com a membrana de micro-organismos. Neste trabalho, comparamos as atividades antimicrobianas e hemoliticas, assim como o indice terapeutico (IT) dos peptideos gomesina, magainina II, protegrina I, taquiplesina I, polifemusina II e seus analogos lineares. A atividade antimicrobiana foi avaliada contra S. aureus, E. coli e C. albicans. As atividades hemoliticas dos peptideos foram avaliadas contra eritrocitos humanos. A microscopia optica foi empregada para estudar a interacao destes peptideos com vesiculas unilamelares gigantes (GUVs), compostas por misturas de um lipidio neutro (POPC) com um lipidio carregado negativamente (POPG). Os resultados mostraram que a gomesina e protegrina I tem a mesma potencia, enquanto que os outros peptideos foram menos ativos contra C. albicans. Protegrina I e taquiplesina I foram os mais potentes contra E.coli e protegrina I foi o mais ativo contra S. aureus (2 a 4 vezes). A maioria dos PAMs estudados apresentaram atividades hemoliticas significativas com excessao da magainina II, que nao foi hemolitica mesmo na concentracao de 100 μM. A magainina II apresentou o melhor IT contra todos os micro-organismos testados. Curiosamente, a gomesina, taquiplesina I, polifemusina II e seus analogos lineares e o analogo linear da protegrina I parecem atuar atraves do modelo de carpete, enquanto a magainina II e a protegrina I formam poros estaveis nas membranas das GUVs. Recentemente, estudos que envolvem a acao de PAMs contra celulas do cancer tem aumentado significatimente. No entanto os mecanismos pelos quais os PAMs regulam a morte celular em mamiferos nao estao bem esclarecidos. Diante do fato, no presente trabalho investigamos a atuacao destes peptideos contra as celulas eritroleucemicas humanas K562. Os resultados mostraram que a gomesina e protegrina I exibiram atividades citotoxicas nao mostradas pelos seus analogos lineares. Taquiplesina I e polifemusina II tambem induziram morte celular e seus analogos lineares nao perderam os efeitos. Atraves dos experimentos realizados foi possivel distinguir duas maneiras que os peptideos induzem morte celular, dependendo da concentracao empregada. Baixas concentracoes dos PAMs induzem mecanismos de morte celular de forma controlada, tais como apoptose, necrose secundaria e necrose/necroptose. Cada PAM testado promoveu morte celular controlada por um mecanismo intracelular diferente. Gomesina, taquiplesina I e [Trp0, Ser3,7,12,16]-taquiplesina I promoveram apoptose que foi caracterizada por anexina, sensibilidade a Z-VAD, e ativacao da caspase-3. Gomesina e protegrina I induziram morte celular que tambem foi dependente de mecanismos intracelulares de Ca2+. Necrostatina-1 tambem foi capaz de inibir a morte celular provocada pela gomesina, taquiplesina I e [Trp0, Ser4,8,13,17]-polifemusina II. Por outro lado o tratamento com concentracoes mais elevadas dos PAMs, acima da EC50, resultou principalmente em ruptura da membrana com diferentes acoes na membrana celular. Assim, em concentracoes de PAMs abaixo da EC50, a morte celular controlada pode ser induzida, mas em altas concentracoes ocorrem perturbacoes direta na membrana
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    Acesso aberto (Open Access)
    Síntese, estudos conformacionais e do mecanismo de ação da gomesina
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-01-27) Domingues, Tatiana Moreira [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A gomesina (Gm) é um potente peptídeo antimicrobiano catiônico. Este peptídeo e seu análogo linear [Ser2,6,11,15]-Gm, com menor atividade lítica, foram sintetizados pela metodologia da fase sólida, empregando-se a estratégia t-Boc. Neste estudo, investigamos a interação da Gm e da [Ser2,6,11,15]-Gm com vesículas unilamelares gigantes (GUVs), compostas por membranas lipídicas de POPC ou POPC/POPG, através de microscopias óticas de contraste de fase e fluorescência. As análises se dividiram em duas diferentes partes. Na primeira, observou-se o efeito da injeção de uma solução peptídica, com micropipeta, na vizinhança das GUVs. Como resultado da interação peptídeo/lipídio, as GUVs foram desestabilizadas e romperam-se rapidamente, sem observação de formação de poros estáveis durante todo o experimento. Nos estudos controles, em ausência de peptídeo, as GUVs não romperam de forma espontânea. Peptídeos marcados com a sonda fluorescente rodamina (Rh) foram injetados e mostram que a Gm primeiramente acumula-se na superfície da vesícula, na qual, então, pequenas partículas de alto-contraste são formadas e ocorre, eventualmente, a destruição das GUVs. Este fato leva-nos a especular que a Gm rompe as membranas via modo carpete. Na segunda parte, uma solução contendo GUVs foi misturada a crescentes concentrações peptídicas para quantificação da ação lítica destes peptídeos em vesículas de diferentes composições lipídicas. O efeito de atividade lítica observado foi maior que 90% em baixas concentrações tanto de Gm quanto de [Ser2,6,11,15]-Gm em GUVs compostas de POPC, lipídio eletricamente neutro, e de uma mistura de POPG, negativamente carregados, a POPC em diferentes proporções. Estudos conformacionais foram feitos por duas técnicas espectroscópicas distintas: dicroísmo circular (CD) e fluorescência. A Gm e seu análogo linear aparentemente interagiram com as cargas negativas de SDS nas concentrações acima e abaixo da CMC. Os espectros de CD da [Ser2,6,11,15]-Gm em água apresentaram uma banda fortemente negativa em 198 nm, indicando tratar-se de uma estrutura desordenada, como esperado para peptídeos livres em solução, e não de uma dobra beta como apresentada pela Gm. A partir dos resultados obtidos, foi possível concluir que ambos os peptídeos analisados interagem com vesículas compostas por fosfolipídios e induzem o vazamento de seu conteúdo interno dependentemente da carga de membrana destas, o que corrobora estudos prévios que sugerem que as interações eletrostáticas com a bicamada lipídica dos micro-organismos representam um importante papel no mecanismo de ação da Gm.