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    ATP sulfurilase: sua relação com o fator de transcrição Cys3 e a regulação da biossíntese dos aminoácidos sulfurosos em Cryptococcus neoformans
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-01-22) Meneghini, Mariana Reis [UNIFESP]; Pascon, Renata Castiglioni [UNIFESP]; Martho, Kevin Felipe; http://lattes.cnpq.br/3222282659352681; http://lattes.cnpq.br/4203540318082044; http://lattes.cnpq.br/1490092712517613
    C. neoformans é um fungo oportunista que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos causando infecções letais como a meningite criptococócica. Em decorrência da resistência deste patógeno aos medicamentos atuais, da escassez de antifúngicos e de tratamentos ineficazes, o estudo sobre os mecanismos de virulência e as interações entre patógeno e hospedeiro são de grande importância médica. Os fungos são eucariotos, assim como os seus hospedeiros, tornando muito difícil a identificação de novos alvos farmacológicos que tenham alta toxidade seletiva. A via de síntese de aminoácidos sulfurosos é exclusiva das bactérias, plantas, parasitas e dos fungos, é de extrema importância para a sobrevivência de C. neoformans in vitro e in vivo e representa um potencial alvo de inibidores com alta toxicidade seletiva. Os mecanismos de regulação desta rota de biossíntese têm sido muito estudados, sendo que o fator de transcrição central, Cys3, controla a ativação de vários genes desta via biossintética. Nossos estudos anteriores de imunoprecipitação e espectrometria de massas apontaram que Cys3 faz parte de um complexo contendo duas fosfatases (calcineurina subunidade catalítica e regulatória e a fosfatase Gpp2), as quais foram confirmadas como sendo parte deste complexo regulatório. Uma quarta proteína, a ATP sulfurilase foi identificada, mas ainda não havia sido confirmada como participante deste complexo. A primeira etapa deste trabalho confirmou a hipótese de que a ATP sulfurilase codificada pelo gene MET3 interage fisicamente com a proteína Cys3 e com a subunidade regulatória da calcineurina (Cna1-ߡC) pela técnica de interação entre proteínas por duplo híbrido em S. cerevisiae. A segunda parte deste trabalho teve por objetivo deletar o gene MET3 na linhagem contendo a construção Gfp-Cys3. Foram feitos experimentos de deleção gênica, mas devido às restrições para o trabalho presencial durante a pandemia do Covid-19 não foi possível cumprir todos os objetivos propostos. Neste trabalho de conclusão de curso serão apresentados os resultados de deleção gênica e análise fenotípica dos transformantes obtidos por biolística e posteriormente por eletroporação usando o sistema CRISPR-Cas9.
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    Seleção de fungos filamentosos como eficientes fontes de lignina-peroxidases
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2020-08-21) Lima, Lidiane Maria dos Santos [UNIFESP]; Vasconcellos, Suzan Pantaroto de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo
    Selection of Filamentous Fungi as Efficient Sources of Lignin-Peroxidases Lignin peroxidases (LiP) are ligninolytic enzymes normally produced by biodegradable fungi of lignocellulose in nature. Currently, interest in such enzymes has increased, due to their high potential for biotechnological application. In this sense, the search for microbial cultures, of different habitats, with different environmental conditions, exponentially increases the acquisition of notable enzymes for the most diverse purposes. An example is the application of biorefineries of cellulosic ethanol, which aims at the efficient transformation of lignocellulosic biomass into bioproducts, such as biofuels and energy, thus being considered a sustainable alternative to petroleum derivatives. However, one of the obstacles to the lignocellulose valorization on an industrial scale is the complexity and recalcitrance of biomass, especially lignin. It is in this context that the development and optimization of enzymatic preparations based on lignin-peroxidases are required, in order to enable the cleavage and digestibility of lignocellulosic fiber. Thus, the present study was initiated by the screening of environmental filamentous fungi with respect to the effectiveness of lignin-peroxidases, using dye degradation tests of aromatic molecular structures, such as remazol brilliant blue R (RBBR) and methylene blue (AM), as compounds for detecting fungal ligninolytic activity. Thus, six (6) filamentous fungi FPZSP3_01, FPZSP3_05, FPZSP3_47, FPZSP3_91, FPZSP1_129 and FPZSP1_141 isolated from soil increased by filter cake from sugar and alcohol refineries, were selected. Thus, such microorganisms were subjected to in-depth analysis about the enzymatic kinetics of their lignin-peroxidases, analyzing the crude enzymatic extract (microbial supernatant) from the following strains: FPZSP3_47 (Mucor sp.), FPZSP1_129 (Byssochlamys nivea) and FPZSP1 (Paecilomyces saturatus). The apparent kinetic constants KM, Vmax and kcat were determined in two conditions, pH 3.0 at room temperature (20 ºC±2), and pH 9.0, NaCl 4M, at 65 ºC, in addition to the influence of different temperatures, pH ranges and salinities in the activities enzyme detected. The filamentous fungus Mucor sp. (FPZSP3_47) belonging to the phylum Mucoromycota was selected for protein characterization studies. The apparent kinetic constants KM (mM) 55.65 ± 6.56, Vmax (mmol min-1) 414.75 ± 6.37 and kcat (min-1) 7.45 were higher at pH 3.0 at room temperature for Mucor sp. FPZSP3_47. The lignin-peroxidases of Mucor sp., Byssochlamys nivea and Paecilomyces saturatus exhibited activity and stability for 30 hours at all temperatures evaluated (4 ºC, ambient, 30 ºC and 65 ºC), with two optimal temperatures (30 ºC and 65 ºC) being selected. ºC). Such conditions were selected to analyze the activity dependence and enzymatic stability at pH. All ligninases of Mucor sp., Byssochlamys nivea and Paecilomyces saturatus were active and stable over a wide pH range (5.0 to 9.0). The pH 9.0 and the temperature of 65 ºC were selected to investigate the effect of NaCl (0.1 to 4 M) on the stability of LiP, and the results revealed wide tolerance to NaCl, for 24 hours. The LiP of the isolate Mucor sp. was purified by ion-exchange chromatography and analyzed on SDS-PAGE 12%, featuring a protein with a molecular mass estimated at 60 kDa and specific activity of 0.013 U/mg. It is worth mentioning that this is the first description of ligninases of a fungus of the genus Mucor sp. in the literature, therefore, a potential candidate for the optimization of processes associated with the production of ethanol from vegetable biomass.