Navegando por Palavras-chave "Citrulinação"

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    Acesso aberto (Open Access)
    Caracterização do autocitrulinoma das células ECV304 e sua utilização como fonte de antígenos citrulinados in vitro para detecção de autoanticorpos na artrite reumatoide
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-10-08) França, Natalia Regine de [UNIFESP]; Andrade, Luiz Eduardo Coelho [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3012990107397690; http://lattes.cnpq.br/9606565258812948
    Proteínas citrulinadas contêm epítopos citrulinados que são especificamente reconhecidos por anticorpos antiproteínas/peptídeos citrulinadas (ACPA), um dos principais sistemas de autoanticorpos na artrite reumatoide (AR). A inflamação pode promover citrulinação de diversas proteínas mediante um processo enzimático realizado pela enzima peptidilarginina deiminase (PAD) que leva à conversão do aminoácido arginina em citrulina. Os ACPA são biomarcadores importantes na AR com relevância na patogênese, diagnóstico e prognóstico da enfermidade. Nesse trabalho, investigamos a presença de enzimas PAD e exploramos a o potencial de citrulinação da linhagem celular ECV304 e sua possível utilização como substrato antigênico para imunoensaios para pesquisa de ACPA em pacientes com AR. Um teste de ELISA in-house foi desenvolvido com extrato de células ECV304 como substrato antigênico para detecção de ACPA, sendo validado com duas coortes de pacientes de AR e controles. Soros de pacientes com AR com altos títulos de ACPA foram utilizados para a análise do citrulinoma-ECV304. Objetivo: Caracterizar a linhagem celular ECV304 em relação a sua capacidade de citrulinação in vitro e descrever seu citrulinoma, para possível utilização do extrato celular citrulinado como substrato antigênico em imunoensaio para detecção de ACPA em pacientes sob suspeita de AR. Métodos: Citrulinação proteica foi verificada por Western blot em sete linhagens celulares humanas. A produção de citrulina foi quantificada por ensaio colorimétrico. As enzimas PAD, envolvidas no processo de citrulinação nas células ECV304, foram identificadas por PCR com primers específicos. Proteínas citrulinadas reconhecidas pelo soro de pacientes com AR, foram imunoprecipitadas e identificadas por espectrometria de massas para caracterização do citrulinoma. Um sistema de ELISA in-house utilizando extrato de células ECV304 (citrulinado e controle) foi testado utilizando soro de pacientes com AR (n=177), soro de pacientes com outras doenças reumáticas (não-AR) (n=59) e soro de indivíduos sadios (n=25). Os resultados foram expressos pela diferença entre as densidades óticas com o extrato citrulinado (CIT) e não citrulinado (CTR) (Delta = CIT DO405 – CTR DO405). O valor de corte foi estabelecido utilizando análise da curva ROC. Resultados: A linhagem celular humana ECV304, dentre as demais testadas, foi a única a apresentar capacidade abundante de citrulinar as próprias proteínas. Células ECV304 possuem as isoenzimas PAD2 e PAD3 e as proteínas próprias citrulinadas foram detectadas pelos autoanticorpos presentes no soro de pacientes com AR (Western Blot e ELISA). O ELISA in-house apresentou uma sensibilidade de 50% e uma especificidade de 95,2% para AR. Análise proteômica de extratos celulares citrulinados imunoprecipitados com três soros de AR identificou proteínas citrulinadas antigênicas previamente descritas em AR: calreticulina, profilina 1 e vinculina. Novos alvos citrulinados foram identificados, como: proteína 14-3-3 beta/alfa, proteína 14-3-3 zeta/delta, peroxiredoxina-5 mitocondrial e transcetolase. Conclusão: As células ECV304 expressam dois isotipos de enzimas PAD e são capazes de citrulinar proteínas próprias, que são reconhecidas por autoanticorpos no soro de AR. Essa linhagem celular representa uma ferramenta de pesquisa única para estudar a biologia e bioquímica do processo de citrulinação. Ela pode ser utilizada como fonte natural antigênica para detecção de autoanticorpos contra proteínas citrulinadas, podendo representar uma alternativa futura para o diagnóstico de AR. Pode também contribuir para estudos de inibição de citrulinação pelas drogas antirreumáticas e para medicina de precisão e personalizada através da identificação de proteínas citrulinadas alvos em diferentes estágios da doença de forma individual nos pacientes com AR.