Navegando por Palavras-chave "CRISPR"

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    Acesso aberto (Open Access)
    Amplificação isotérmica associada a CRISPR-Cas12 para diagnóstico rápido e específico da COVID-19
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-04-01) Sousa, Ana Caroline de Castro Nascimento [UNIFESP]; Moretti, Nilmar Silvio [UNIFESP]; Maricato, Juliana Terzi [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8321096323728598; http://lattes.cnpq.br/2131472726202687; http://lattes.cnpq.br/7333150112556491
    A pandemia causada pelo SARS-CoV-2 (COVID-19) criou um novo desafio de saúde pública para as autoridades em todo o mundo. O alto custo de testes diagnósticos confiáveis e a dependência de insumos importados para a execução destes testes, impossibilitando assim a testagem massiva da população, torna fundamental o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico rápidos e precisos para o SARS-CoV-2. Entre as estratégias recentemente testadas, e aprovadas pelo U.S Food and Drug Administration (FDA), está o uso da metodologia de LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), isolada ou combinada à tecnologia de CRISPR/Cas12. Neste trabalho, através da validação da metodologia de LAMP, verificamos a eficiência de enzimas nacionais parceiras na detecção do gene N, E e RdRp do SARS-CoV-2 nas amostras, utilizando tanto RNA como DNA como molde, demonstrando assim uma performance compatível à dos kits comerciais importados já utilizados. Além disso, visando diminuir os custos para realização destes ensaios, realizamos em nosso laboratório a padronização de todas as etapas de expressão e purificação de enzimas Cas12a provenientes de diferentes espécies de bactérias, assim como a síntese de seus sgRNAs, comparando sua eficiência na detecção do SARS-CoV-2 em ensaios in vitro. Em seguida, validamos os ensaios de detecção do SARS-CoV-2 que utilizam a atividade inespecífica da Cas12a após detecção do alvo de interesse, acoplada a uma molécula fluorescente para confirmação do diagnóstico e determinamos assim a dependência do mecanismo à correta formação do complexo RNP-Cas12a, além de sua especificidade e sensibilidade, na presença de plasmídeos carregando a sequência dos genes de diferentes vírus e utilizando diferentes concentrações de um plasmídeo contendo a sequência do gene N de SARS-CoV-2. Verificamos, adicionalmente, a termoestabilidade das enzimas expressas em nosso laboratório, que mostraram funcionalidade em variadas temperaturas (25-75°C), revelando assim seu potencial para aplicação no campo biotecnológico. Finalmente, realizamos uma prova de conceito desta metodologia, utilizando amostras de pacientes com COVID-19 previamente confirmadas por diagnóstico molecular por qRT-PCR, e demonstramos que o sistema é capaz de detectar com especificidade diferentes tipos de alvo, promovendo um grande aumento no sinal fluorescente nas amostras contendo produtos de LAMP em relação ao controle. Nossos resultados indicam que é possível implementar a metodologia de LAMP-Cas12a utilizando tecnologia 100% nacional, como alternativa as metodologias já descritas, aumentando a sensibilidade e diminuindo o tempo e os custos para o diagnóstico molecular laboratorial do SARS-CoV-2. Esses achados apontam ainda para o seu potencial em abordagens que utilizam o conceito point of care (P.O.C) e que, futuramente, podem se estender ao diagnóstico de outras doenças infecciosas de importância econômica e sanitária.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Correction of Monogenic and Common Retinal Disorders with Gene Therapy
    (Mdpi, 2017) Sengillo, Jesse D.; Justus, Sally; Cabral, Thiago [UNIFESP]; Tsang, Stephen H.
    The past decade has seen major advances in gene-based therapies, many of which show promise for translation to human disease. At the forefront of research in this field is ocular disease, as the eye lends itself to gene-based interventions due to its accessibility, relatively immune-privileged status, and ability to be non-invasively monitored. A landmark study in 2001 demonstrating successful gene therapy in a large-animal model for Leber congenital amaurosis set the stage for translation of these strategies from the bench to the bedside. Multiple clinical trials have since initiated for various retinal diseases, and further improvements in gene therapy techniques have engendered optimism for alleviating inherited blinding disorders. This article provides an overview of gene-based strategies for retinal disease, current clinical trials that engage these strategies, and the latest techniques in genome engineering, which could serve as the next frontline of therapeutic interventions.