Navegando por Palavras-chave "Alternative Splicing"

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    Identificação de novos tipos de splicing alternativo do gene TCIRG1 em diferentes tecidos humanos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2003) Smirnova, Anna [UNIFESP]; Gerbase-Lima, Maria [UNIFESP]
    O objetivo do nosso trabalho foi a investigacao de novos tipos de splicing alternativo do gene TCIRG1 em tecidos humanos variados. Para tanto, houve necessidade de inicialmente elaborarmos um metodo de amplificacao especifica de variantes de splicing com delecao de uma parte. Metodos: Atraves de busca virtual na base de dados de EST selecionamos possiveis novas isoformas do TCIRG1. A expressao de formas de splicing do gene em 30 tecidos humanos foi estudada por RT-PCR. Para deteccao de variantes de splicing com delecao de uma parte, usamos PCR com primer abrangendo a juncao dos exons. Resultados: Em relacao a padronizacao do metodo de amplificacao com primer abrangendo a juncao dos exons: sugerimos definir o limite da especificidade da deteccao do transcrito alternativo considerando a quantidade do transcrito principal; demonstramos que a adicao de poucas moleculas do DNA competidor para o transcrito alternativo dramaticamente aumenta a especificidade da reacao e aplicamos esta estrategia para a deteccao especifica de um dos transcritos do TCIRG1. Em relacao a caraterizacao de variantes de splicing: descobrimos seis novos eventos de splicing alternativo do gene TCIRG1 e observamos sua ocorrencia na maioria dos 30 tecidos estudados; alem disso, observamos a ocorrencia, em varios tecidos de individuos normais, de dois dos tres eventos de splicing alternativo do gene TCIRG1 anteriormente encontrados somente em um paciente com osteopetrose maligna infantil. Demonstramos que diferentes eventos de splicing alternativo do TCIRG1 podem combinar-se e gerar multiplas variantes de transcritos. Conclusoes: Os nossos dados indicam que o splicing do TCIRG1 e extremamente complexo e pode estar submetido a regulacao dependente do tecido. A mudanca de leitura proteica, que acontece na maioria das variantes estudadas, provavelmente levaria a producao de moleculas mais curtas. Mais estudos sao necessarios para definir a expressao relativa e a distribuicao tecidual das multiplas variantes de transcrito do TCIRG1 geradas por combinacoes d varios eventos de splicing alternativo
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    Somente Metadadados
    Splicing alternativo e polimorfismo gênico de moléculas do sistema imune
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006) Smirnova, Anna [UNIFESP]; Gerbase-Lima, Maria [UNIFESP]
    Muitos genes do genoma humano apresentam variações na sequência de DNA (polimorfismos) e também variações no splicing de mRNA (variantes de splicing, VS). A expressão de VS pode ser regulada dependendo do tipo e do estado de ativação celular, e também ser influenciada por polimorfismos. Os objetivos desta tese foram: (1) realizar busca de VS de 10 genes imunorregulatórios (TC/RG1, L TA, L TB, OX40, OX40L, BAFF, APR/L, BAFF-R, BCMA, e TACI) em células mononucleares do sangue periférico ativadas e não ativadas; (2) caracterizar polimorfismos de genes que se mostrassem interessantes em relação a VS; (3) estudar a expressão das VS dos genes selecionados em relação aos polimorfismos deste gene, ativação e tipo de linfócitos. Métodos: Novas VS foram identificadas por busca no banco de dados de ESTs e screening por RT-PCR (reverse-transcriptase polymerase chain reaction). A sua expressão foi quantificada por RT-PCR semi-quantitativo ou em tempo real. Os polimorfismos foram caracterizados utilizando enzimas de restrição e sequenciamento. Resultados: (1) identificamos sete novas VS do gene L TA, duas de BAFF e quatro de BCMA em células mononucleares de sangue periférico; todas elas podem codificar isoformas diferentes de proteína, a maioria truncadas; (2) verificamos que a expressão das VS do L TA é regulada diferencialmente em linfócitos ativados; (3) observamos que as VS do BAFF se expressam em baixos níveis em todos os tipos de células estudados e, as do BCMA, somente em células CD19+; (4) elaboramos uma nova estratégia para definição de haplótipos e provamos sua eficiência em relação aos haplótipos do gene L TA, em 102 indivíduos; (5) observamos expressão diferente de alelos do L TA em células de indivíduos heterozigotos, sem haver diferença na expressão entre indivíduos homozigotos. Conclusões: Apesar de haver dados abundantes no banco de ESTs, a busca experimental de novas VS é necessária. No exemplo do L TA, sugerimos que mesmo VS com ORF truncado e de baixa expressão podem ter importância funcional, pois são reguladas diferencialmente durante ativação de linfócitos. A nova estratégia de detecção de haplótipos, proposta neste estudo, é rápida e eficiente e pode ser aplicada para vários genes, principalmente para os quais em que a detecção, por RFLP, de pelo menos um polimorfismo já tenha sido padronizada. O estudo de expressão do LTA em relação aos polimorfismos indica a existência de um mecanismo de regulação de expressão dos alelos que atua somente quando os dois alelos estão presentes no mesmo indivíduo.