Líquidos iônicos como extratores verdes para obtenção de carotenoides da casca de laranja
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Data
2019-12-04
Autores
Murador, Daniella Carisa [UNIFESP]
Orientadores
Rosso, Veridiana Vera de [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
The increased concern about environmental and sustainability issues has encouraged the search for alternative strategies in several productive fields, in order to minimize the environment impacts and the risks to living beings. Ionic liquids are molten salts with low vapor pressure, and negligible toxicity compared to the conventional solvents, which have been successfully applied in the extractions of bioactive compounds. However, there are still scarce publications regarding the biological activity from these extracts. Brazil is responsible for 50% of worldwide orange juice production, implying in high amounts of waste, which could be harnessed as carotenoids source, a natural pigment with antioxidant properties, and mostly found as hydroxylated in the orange peel. The hydroxylated carotenoids can be naturally present in its free form or esterified to fatty acids, which increases the analysis complexity. There are few studies regarding the characterization of native carotenoids extracts, including esters and chlorophylls, especially after being submitted to bioaccessibility and bioavailability assays. Thus, the present study aimed to develop a new method of carotenoids extraction from orange peel, using ionic liquid; characterize saponified and nonsaponified extracts obtained with ionic liquid, comparing them to extracts obtained with conventional solvent; and evaluate their thermal stabilities, antioxidant activities and behavior after bioaccessibility and cellular uptake assays. The new extraction developed used 1-nbutyl-3-methylimidazolium ([C4mim]Cl) as ionic liquid, ultrasonic-assisted, resulting in a total carotenoids content of 32.08 µg/g, while the conventional extraction using acetone achieved 7.88 µg/g. The major carotenoids detected by HPLC-DAD-MSn in the saponified samples from orange peel were: 9-cis-violaxanthin and all-trans-lutein, while in the native extracts (non-saponified) were: all-trans-lutein and all-trans-zeaxanthin. In the native extracts, it was found a total of 5 free carotenoids, being 1 apocarotenoid; 7 monoesters; and 11 diesters, being the esters derived from violaxanthin, lutein and anteraxanthin. The antioxidant activity against peroxyl radical found for the [C4mim]Cl extract was double compared to the acetone extract, and the half-live from [C4mim]Cl extract was higher than the acetone one, meaning that the first one also presented higher thermal stability. After the in vitro simulated digestion according to the INFOGEST adapted protocol, both extracts did not differ significantly; 26.2% and 22.0% of total carotenoids were bioacessible, and 69.7% and 45.9% of chlorophylls were bioacessible in [C4mim]Cl and acetone extracts, respectively. The bioacessibility of xanthophylls and carotenes were significantly higher than from mono- and diesters. The uptake by Caco-2 cells of the total carotenoids varied from 131.9 to 130.2 8 ng/mg of cellular protein, and for chlorophylls varied from 234.2 to 243.8 ng/mg of cellular protein, in [C4mim]Cl and acetone extracts, respectively. Overall, in both extracts, xanthophylls and esters were better absorbed by Caco-2 cells than carotenes. Summing up, this work resulted in the obtaining of a carotenoid extract from an orange sub-product, using ionic liquid. The saponified and non-saponified extracts were characterized, contributing to the elucidation of a better understanding about the biological effects from these compounds. The extracts obtained with [C4mim]Cl presented higher yield and thermal stability than the acetone extracts, besides maintaining their antioxidant activity, and showing to be potentially bioacessible and bioavailable, representing a viable alternative to substitute artificial pigments for natural ones.
A crescente conscientização em relação a questões ambientais e de sustentabilidade tem incentivado a busca por estratégias alternativas em diversas áreas produtivas, que minimizem o impacto ao meio ambiente e os riscos aos seres vivos. Os líquidos iônicos são sais fundidos, que apresentam baixa pressão de vapor, e toxicidade insignificante comparada a dos solventes convencionais, e que vêm sendo aplicados com sucesso nos processos de extração de compostos bioativos, porém, ainda pouco se tem publicado a respeito de ensaios sobre a atividade biológica desses extratos. O Brasil é responsável por 50% da produção mundial de suco de laranja, implicando na geração de grandes quantidades de resíduos, que poderiam ser aproveitados enquanto fonte de carotenoides, um pigmento natural com propriedades antioxidantes, e presente majoritariamente hidroxilados na casca de laranja. Os carotenoides hidroxilados podem ser encontrados naturalmente na sua forma livre ou esterificados a ácidos graxos, aumentando a complexidade da análise neste segundo caso. São poucos os estudos que caracterizam os extratos nativos de carotenoides, incluindo ésteres e possíveis clorofilas que podem ser juntamente extraídas, sobretudo aqueles que avaliam essa composição em amostras submetidas a ensaios de bioacessibilidade e biodisponibilidade. Desta maneira, este trabalho teve como objetivos estabelecer um novo método de extração de carotenoides da casca de laranja, utilizando líquidos iônicos; caracterizar extratos saponificados e nativos obtidos a partir desta extração, comparando-os com extratos obtidos com solvente convencional; e avaliar suas estabilidades térmicas, atividades antioxidantes, e seus comportamentos após os ensaios de bioacessibilidade e uptake celular. O método de extração desenvolvido utilizou cloreto de 1-n-butil-3-metilimidazálio ([C4mim]Cl) como líquido iônico, mediada por homogeneização em probe de ultrassom, levando à obtenção de 32,08 µg/g de carotenoides totais, enquanto a extração convencional utilizando acetona resultou em 7,88 µg/g. Os carotenoides majoritários identificados por HPLC-DAD-MSn nas amostras saponificadas de casca de laranja foram: 9-cis-violaxantina e all-trans-luteína, enquanto nos extratos nativos (não saponificados) foram: all-trans-luteína e all-trans-zeaxantina. Nos extratos nativos foram encontrados um total de 5 carotenoides livres, sendo 1 apocarotenoide; 7 monoésteres; e 11 diésteres, sendo os ésteres derivados da violaxantina, luteína e anteraxantina. A atividade antioxidante frente ao radical peroxila do extrato obtido com [C4mim]Cl foi o dobro da encontrada para o extrato obtido com acetone, e a meia-vida do extrato de [C4mim]Cl também foi maior que o de acetona, indicando que o primeiro também apresentou maior estabilidade térmica. Após a simulação da digestão in vitro seguindo o protocolo adaptado da INFOGEST, os extratos obtidos com [C4mim]Cl e acetona não diferenciaram significativamente, sendo 26,2% e 22,0% dos carotenoides totais bioacessíveis, e 68,7% e 45,9% das clorofilas bioacessíveis, respectivamente. A bioacessibilidade das xantofilas e dos carotenos foi significantemente maior que a dos monoe diésteres, em ambos os extratos. O uptake por células Caco-2 dos carotenoides totais variou de 131,9 a 130,2 ng/mg proteína celular, e das clorofilas de 234,2 a 243,8 ng/mg proteína celular, nos extratos de [C4mim]Cl e acetônico, respectivamente. De forma geral, em ambos os extratos, as xantofilas e os ésteres foram melhor absorvidos pelas células Caco-2 do que os carotenos. Em suma, o trabalho resultou na obtenção de um extrato de carotenoides provenientes de um sub-produto da laranja, a partir da extração alternativa com líquido iônico. Extratos saponificados e não-saponificados foram caracterizados, contribuindo com a elucidação de um melhor entendimento sobre os efeitos biológicos dos compostos presentes. Os extratos obtidos com [C4mim]Cl apresentaram maior rendimento e estabilidade térmica, preservaram sua atividade antioxidante, e mostraram-se potencialmente bioacessíveis e biodisponíveis, representando uma alternativa viável de substituição dos corantes artificiais por pigmentos naturais.
A crescente conscientização em relação a questões ambientais e de sustentabilidade tem incentivado a busca por estratégias alternativas em diversas áreas produtivas, que minimizem o impacto ao meio ambiente e os riscos aos seres vivos. Os líquidos iônicos são sais fundidos, que apresentam baixa pressão de vapor, e toxicidade insignificante comparada a dos solventes convencionais, e que vêm sendo aplicados com sucesso nos processos de extração de compostos bioativos, porém, ainda pouco se tem publicado a respeito de ensaios sobre a atividade biológica desses extratos. O Brasil é responsável por 50% da produção mundial de suco de laranja, implicando na geração de grandes quantidades de resíduos, que poderiam ser aproveitados enquanto fonte de carotenoides, um pigmento natural com propriedades antioxidantes, e presente majoritariamente hidroxilados na casca de laranja. Os carotenoides hidroxilados podem ser encontrados naturalmente na sua forma livre ou esterificados a ácidos graxos, aumentando a complexidade da análise neste segundo caso. São poucos os estudos que caracterizam os extratos nativos de carotenoides, incluindo ésteres e possíveis clorofilas que podem ser juntamente extraídas, sobretudo aqueles que avaliam essa composição em amostras submetidas a ensaios de bioacessibilidade e biodisponibilidade. Desta maneira, este trabalho teve como objetivos estabelecer um novo método de extração de carotenoides da casca de laranja, utilizando líquidos iônicos; caracterizar extratos saponificados e nativos obtidos a partir desta extração, comparando-os com extratos obtidos com solvente convencional; e avaliar suas estabilidades térmicas, atividades antioxidantes, e seus comportamentos após os ensaios de bioacessibilidade e uptake celular. O método de extração desenvolvido utilizou cloreto de 1-n-butil-3-metilimidazálio ([C4mim]Cl) como líquido iônico, mediada por homogeneização em probe de ultrassom, levando à obtenção de 32,08 µg/g de carotenoides totais, enquanto a extração convencional utilizando acetona resultou em 7,88 µg/g. Os carotenoides majoritários identificados por HPLC-DAD-MSn nas amostras saponificadas de casca de laranja foram: 9-cis-violaxantina e all-trans-luteína, enquanto nos extratos nativos (não saponificados) foram: all-trans-luteína e all-trans-zeaxantina. Nos extratos nativos foram encontrados um total de 5 carotenoides livres, sendo 1 apocarotenoide; 7 monoésteres; e 11 diésteres, sendo os ésteres derivados da violaxantina, luteína e anteraxantina. A atividade antioxidante frente ao radical peroxila do extrato obtido com [C4mim]Cl foi o dobro da encontrada para o extrato obtido com acetone, e a meia-vida do extrato de [C4mim]Cl também foi maior que o de acetona, indicando que o primeiro também apresentou maior estabilidade térmica. Após a simulação da digestão in vitro seguindo o protocolo adaptado da INFOGEST, os extratos obtidos com [C4mim]Cl e acetona não diferenciaram significativamente, sendo 26,2% e 22,0% dos carotenoides totais bioacessíveis, e 68,7% e 45,9% das clorofilas bioacessíveis, respectivamente. A bioacessibilidade das xantofilas e dos carotenos foi significantemente maior que a dos monoe diésteres, em ambos os extratos. O uptake por células Caco-2 dos carotenoides totais variou de 131,9 a 130,2 ng/mg proteína celular, e das clorofilas de 234,2 a 243,8 ng/mg proteína celular, nos extratos de [C4mim]Cl e acetônico, respectivamente. De forma geral, em ambos os extratos, as xantofilas e os ésteres foram melhor absorvidos pelas células Caco-2 do que os carotenos. Em suma, o trabalho resultou na obtenção de um extrato de carotenoides provenientes de um sub-produto da laranja, a partir da extração alternativa com líquido iônico. Extratos saponificados e não-saponificados foram caracterizados, contribuindo com a elucidação de um melhor entendimento sobre os efeitos biológicos dos compostos presentes. Os extratos obtidos com [C4mim]Cl apresentaram maior rendimento e estabilidade térmica, preservaram sua atividade antioxidante, e mostraram-se potencialmente bioacessíveis e biodisponíveis, representando uma alternativa viável de substituição dos corantes artificiais por pigmentos naturais.