PPG - Microbiologia e Imunologia
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- ItemAnálise genomica comparativa de Trypanosoma dionisii com linhagens de Trypanosoma cruzi restritas a morcegos e de uma cepa virulenta de T. cruzi (clone CL Brener)(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-12) Pereira, Werica Bernardo [UNIFESP]; Silveira Filho, José Franco da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8810765839775059; http://lattes.cnpq.br/7014192766092756Tripanossomas de morcegos têm sido objeto de estudos sobre a história evolutiva do Trypanosoma cruzi. Foi proposto que T. cruzi e Trypanosoma rangeli evoluíram de uma linhagem de tripanossomas de morcegos adaptados a mamíferos terrestres (hipótese de semeadura de morcegos). Utilizando diferentes abordagens genômicas, comparamos o genoma de Trypanosoma dionisii (Tdio) com aqueles de cepas de T. cruzi restritas a morcegos (Trypanosoma cruzi marinkellei - Tcmar; T. cruzi Bat -TcBat) e uma cepa virulenta de T. cruzi (CL Brener , CLB). Por todas as métricas utilizadas, o Tdio possui um tamanho de genoma menor que o T. cruzi CLB, Tcmar TcBat e Tcmar. Os genes parálogos e membros de famílias multigênicas estão em menor número no genoma do Tdio. Além disso, seu cariótipo é composto por cromossomos de menor tamanho. A análise de genes ortólogos no genoma completo identificou clusters compartilhados entre os isolados estudados (Tdio, T. cruzi CLB, Tcmar e TcBat) e clusters compartilhados apenas por tripanossomas de morcegos. Também identificamos clusters específicos para cada isolado, os quais estão enriquecidos em famílias multigênicas e proteínas hipotéticas que representam novas variantes geradas por recombinação e mutação. A análise genômica sugere que Tcmar e TcBat sejam parentes próximos da linhagem TcI de T. cruzi e ainda estão em curso de especiação. Nossas análises também mostraram que Tdio é o primeiro tripanosoma do clado T. cruzi que alberga duas classes de retroposons, o elemento L1Tc característico dos tripanossomas do clado T. cruzi, e também o retroposon Tbingi descrito no clado T. brucei. L1Tc e Tbingi são retroposons autônomos longos do clado Ingi. A presença de Tbingi e L1Tc em Tdio também foi descrita em Trypanosoma congolense. A presença de Tbingi em Tdio poderia ser explicada pela transferência horizontal durante a evolução dessas espécies ou que a linhagem ancestral abrigava ambos os retroelementos antes da especiação dos tripanossomas africanos e americanos. Para investigar a sintenia entre os genomas de Tdio e T. cruzi, os scaffolds de Tdio foram alinhados com os cromossomos de T. cruzi. Vários ascaffold de Tdio correspondem a 40-60% do tamanho dos cromossomos do T. cruzi com identidade de 75-85%. Há uma notável conservação da ordem dos genes, embora possam ocorrer rearranjos, deleções e duplicações. Entre os blocos sintênicos T. cruzi-CLB e TcBat, a identidade variou de 90-98% com conservação da ordem genética. A análise de aCGH identificou elevada proporção de eventos de perdas de DNA em isolados de morcegos Trypanosoma (Tdio, Tcmar e TcBat) em relação ao genoma de referência (T. cruzi CLB). O elevado número de alterações de perdas de DNA nesses isolados pode ser devido à expansão do genoma em T. cruzi, principalmente nas linhagens híbridas como CLB. O conteúdo gênico das alterações de perda foi associado a famílias multigênicas, em concordância com a redução dessas famílias no genoma dos tripanossomas de morcegos. Observamos que as alterações de perda são flanqueadas por membros de famílias multigênicas, sugerindo que esses genes desempenham um papel importante nos eventos de recombinação. Por outro lado, genes hipotéticos de proteínas estão associados a regiões de ganho. Alterações de perda também foram identificadas em grandes extensões dos cromossomos, sugerindo a presença de aneuploidia segmentar e cromossômica em Tcmar, TcBat e Tdio. A maioria dos scaffolds de Tdio foram mapeados em um único cromossomo homólogo em T. cruzi CLB. No entanto, vários scaffolds foram mapeados em 2 cromossomos diferentes de CLB, sugerindo que alguns cromossomos Tdio seriam híbridos, compostos de segmentos de diferentes cromossomos de T. cruzi. Os dados de aCGH e sequenciamento genomico indicam a ausência em Tdio de um compartimento genômico disruptivo, o qual é enriquecido em famílias multigênicas envolvidas no escape do parasita do sistema imunológico e na invasão da célula hospedeira. Vários genes envolvidos na invasão celular por tripomastigotas de T. cruzi, glicoproteínas de superfície não foram detectados em Tdio. Os resultados sugerem que a estrutura do genoma do Tdio é muito semelhante à do T. cruzi em termos de conteúdo gênico e colinearidade, mas com diferenças no número de cópias e na distribuição das famílias multigênicas.
- ItemPapel do complexo Ikaros-HDAC na regulação da expressão de micro-RNAs apoptóticos por linfócitos B-1(Universidade Federal de São Paulo, 2023-11-01) Costa, Lucas Vasconcelos Soares [UNIFESP]; Popi, Ana Flavia [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6073701470193039; http://lattes.cnpq.br/5604107493098752Os linfócitos B-1, um subtipo de células B, podem expressar o marcador CD5 e são responsáveis pela produção de IgM natural. Além disso, são capazes de autorrenovação e reconhecimento de autoantígenos, o que poderia facilitar sua diferenciação em células hiperproliferativas. De fato, estas células estão envolvidas no desenvolvimento da leucemia linfocítica crônica (LLC), caracterizada pelo aumento de células B-1 com expressão de CD5 e IgM, além de BCR responsivo a autoantígenos. A principal característica da LLC é a intensa atividade proliferativa de linfócitos B-1 CD5+CD23+ na medula óssea e órgãos linfoides e consequente acúmulo de células resistentes à morte no sangue periférico. Dentre as moléculas envolvidas na patogênese, os fatores de transcrição da família Ikaros (Ikzf1) encontram-se alterados. A principal forma de atividade de Ikaros se dá pela associação a complexos, que envolvem a presença de histonas deacetilases (HDAC) em especial a HDAC1 e HDAC2. No contexto da LLC, foi descrito que as HDACs se encontram, em sua maioria, super expressas e isto influencia na expressão de micro-RNAs (miRNAs) envolvidos na regulação da apoptose intrínseca. Assim, a proposta deste trabalho é investigar o papel de Ikaros na expressão de microRNAs e moléculas envolvidas na via de apoptose, a fim de fazer uma correlação com a LLC. As células B-1 murinas foram obtidas do peritônio de camundongos C57Bl/6 após o enriquecimento por cell sorting. Primeiramente foi confirmada a co-localização e interação de Ikaros e HDAC1 em células B-1 por imunofluorescência e co-imunoprecipitação respectivamente. A seguir, a expressão de Ikaros foi silenciada nestas células por siRNA e neste cenário, além de uma maior viabilidade celular, foi observado um aumento significativo na síntese de HDAC1 e c-Myc. Em nível proteico, observamos que a perda de Ikaros regula negativamente quase todas as proteínas apoptóticas analisadas. No estudo mais específico das moléculas da via, houve o aumento na expressão de Bcl-2 e da forma clivada da caspase-3, condizentes com o aumento da viabilidade. O array de miRNAs revelou a mudança na expressão de 37 miRNAS, dentre eles a baixa expressão dos miRNAs -29c e -145. O tratamento com um inibidor de HDACs, além de diminuir a viabilidade celular independente de Ikaros, restaurou os níveis do miR-29c na ausência de Ikaros mas não do miR-145. A super expressão do miR-29c foi capaz de reduzir os níveis de Bcl-2 e aumentar a expressão de Bax, enquanto a super expressão de miR-145, além de reduzir os níveis de c-Myc, aumentou a expressão do miR-29c e diminuiu Bcl-2 e MCL-1. No ensaio funcional, o miR-29c foi capaz de reverter os efeitos da ausência de Ikaros, mas a restauração do miR-145 e a combinação de ambos os miRNAs pareceu levar estas células à morte, além de modular a razão Bcl-2/Bax. Em um segundo modelo de estudo, investigamos a ausência de Ikaros em células B-1 no ambiente medular. Neste modelo, foi observado aumento significativo na viabilidade das células silenciadas sob co-cultura com linhagem células do estroma medular (OP9). Ainda, houve a mudança na expressão de 42 miRNAS, mas a baixa expressão dos miRNAs -29c e -145 se manteve. Os efeitos da inibição das HDACs e da restauração dos miRNAs se manteve como no modelo anterior mesmo com os estímulos fornecidos pelas células estromais. Assim, estes dados confirmam a participação de Ikaros na regulação de moléculas envolvidas na sobrevivência das células B-1, e os mecanismos incluem HDACs e o fator de transcrição c-Myc. Além disso, estes dados indicam que a baixa expressão dos miRNAs -145 e -29c, devido à desregulação de Ikaros, poderia ser uma das vias moleculares para induzir resistência à apoptose em células B leucêmicas. Por fim, foi postulado o miR-145 como um possível alvo terapêutico para a LLC.
- ItemEfeito da exposição à radiação ionizante no ciclo celular, morfologia e crescimento do Trypanosoma cruzi(Universidade Federal de São Paulo, 2024-01-29) Marchiano, Fernanda Sycko [UNIFESP]; Silveira Filho, José Franco da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8810765839775059; http://lattes.cnpq.br/6932738720326743A radiação ionizante induz quebras na dupla fita de DNA e rearranjos cromossômicos em T. cruzi. Para investigar os efeitos da radiação na organização dogenoma de T. cruzi, epimastigotas de CL Brener foram expostos a doses de 100 e 500Gy de radiação gama e analisados quanto ao crescimento em cultura e recuperação do cariótipo. Entre 18 clones isolados por diluição seriada, epimastigotas do clone F9 isolado de uma população exposta à radiação de 500 Gy, apresentou notáveis alterações no crescimento, motilidade e alterações morfológicas no flagelo em meio de cultura axenico. Por coloração de Giemsa e ensaios de imunofluorescência com anticorpos específicos contra proteínas da estrutura flagelar observamos alterações no padrão de fluorescência e morfologia do flagelo que está parcialmente descolado do corpo celular. Análise por microscopia eletrônica corroborou os dados acima e revelou que o cinetoplasto está disposto lateralmente ao núcleo. Para entender o déficit decrescimento do clone F9, estimamos a duração das fases do ciclo celular em epimastigotas em proliferação sincronizados com a hidroxiureia e verificamos que a duração da fase G1 foi significativamente reduzida no mutante. Por meio de ensaios de invasão de células de mamíferos com tripomastigotase multiplicação intracelular foi possível observar redução significativa na invasão pelo clone F9, apesar do parasita ser ainda capaz de perpetuar a infecção. Para compreender as alterações observadas ao nível genômico, utilizamos a técnica de aCGH (“array Comparative Genomic Hybridization”) onde observamos uma série de alterações de ganho e em menor número de perda de DNA. Diversos genes envolvidos em processos biológicos como estrutura flagelar e motilidade, “splicing”, transcrição, tradução, reparo de DNA e ciclo celular foram alterados, sendo a maioria das alterações relacionadas ao ganho de DNA. Estes resultados sugerem que o aumento no número de cópias dos genes por amplificação genica (aneuploidia segmentar ou cromossômica) foi a solução encontrada pelo parasita para compensar os efeitos da radiação. Nas famílias multigênicas envolvidas na invasão de células de mamíferos (MASP, TcMUC, Trans-Sialidase, DGF-1, GP63 e SAP), as perdas foram predominantes e podem ter afetado a capaciade invasiva de tripomastigotas. T. cruzi demonstra ter eficiente mecanismo de reparo, capaz de reparar a degradação cromossômica observada nos parasitas irradiados com dosagens de até 500 Gy. Além de reparo eficiente, o parasita se demonstra ser resiliente às alterações morfológicas em uma organela multifuncional em patógenos, como o flagelo.
- ItemEfeitos da sinalização adrenérgica na atividade efetora de macrófagos in vitro e in vivo(Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-14) Freire, Beatriz Marton [UNIFESP]; Basso, Alexandre Salgado [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6354870792125973; http://lattes.cnpq.br/5942524538589049Macrófagos são células fundamentais para a manutenção da homeostase tecidual, suas funções incluem promoção da inflamação e reparo tecidual. A atividade efetora de macrófagos pode ser modulada por várias substâncias como citocinas, metabólitos, hormônios e até mesmo catecolaminas. A expressão de receptores adrenérgico em leucócitos permite com que haja modulação direta do sistema nervoso simpático nas respostas imunes. O objetivo desse trabalho foi explorar os efeitos do receptor adrenérgico beta-2 (beta-2AR), receptor para catecolaminas, na função efetora de macrófagos in vivo e in vitro. Utilizando macrófagos diferenciados de células-tronco hematopoiéticas (BMDM) nós observamos que a sinalização via beta-2AR culmina com menor produção das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-alpha, e aumento da citocina anti-inflamatória IL-10. A seguir, exploramos os efeitos de beta-2AR na reprogramação metabólica de macrófagos, evento decorrente da ativação clássica de BMDM. Nesse contexto, observamos que ativação de beta-2AR foi capaz de inibir o aumento característico da glicólise aeróbica que ocorre em BMDM ativados classicamente. Análises mais aprofundadas demonstraram que esse fenômeno é mediado pelo controle da produção de óxido nítrico (NO), o que sustenta a respiração mitocondrial e a produção de ATP via OxPhos, dispensando a necessidade de aumentar a via glicolítica para atingir a demanda energética da célula. Adicionalmente, esse trabalho descreveu que o controle da produção de NO envolve a via PKA-Nur77-Arg1. Por último, avaliamos a importância de beta-2AR para controlar a atividade efetora de macrófagos in vivo. Para isso, usamos animais geneticamente modificados, que não expressam o receptor beta-2AR em monócitos, e o modelo de neuroinflamação encefalomielite autoimune experimental, que mimetiza a fisiopatologia da esclerose múltipla. Nós observamos que a falta de 2AR em monócitos culminou com a piora no score clínico da doença, e com o aparecimento precoce de sintomas. Além disso, foi encontrado maior infiltrado inflamatório no sistema nervoso central desses camundongos, com maior frequência de macrófagos inflamatórios infiltrantes. Em conclusão, esse trabalho descreveu que o receptor beta-2AR é importante para controlar a reprogramação metabólica de macrófagos, e por consequência o potencial inflamatório dessas células, descrevendo, portanto, um novo eixo neuro-imuno-metabólico, mediado por beta-2AR -Nur77-Arg1.
- ItemEfeito da sinalização adrenérgica sobre a resposta das células iNKT e a injuria hepática induzida pela α-galactosilceramida(Universidade Federal de São Paulo, 2023-09-11) Bauwelz Gonzatti, Michelangelo [UNIFESP]; Castro Keller, Alexandre [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9264244341601758; http://lattes.cnpq.br/8758972433215336As células T Natural Killer invariantes (iNKT) são linfócitos T não convencionais que reconhecem antígenos lipídicos apresentados por moléculas de CD1d. A produção de citocinas, como TNF-α e IFN-γ, após a estimulação com a α-galactosilceramida (αGC), faz dessas células um excelente alvo para a imunoterapia contra o câncer. Visto que a sinalização adrenérgica inibe a imunovigilância contra tumores e a escassez de conhecimento sobre seu efeito sobre os linfócitos iNKT, buscou-se investigar o impacto da noradrenalina na atividade dessas células. Para tanto, avaliamos a ativação das células iNKT in vitro na presença de noradrenalina e em um modelo in vivo de hiperativação da sinalização adrenérgica (animais Adra2ac-/-), em conjunto com a utilização de agonistas e antagonistas dos receptores adrenérgicos. A produção de citocinas foi avaliada no sobrenadante da cultura celular, no soro dos animais e por marcação intracelular. Foi utilizado um modelo de melanoma murino com células B16F10 para avaliar o impacto da sinalização adrenérgica sobre atividade antitumoral das células iNKT. Análises histológicas e quantificação das enzimas hepáticas TGP e TGO foram realizadas para avaliar a lesão do fígado. Utilizou-se citometria de fluxo para avaliar as dinâmicas celulares no pulmão e fígado após a ativação das células iNKT. Nos ensaios realizados, a sinalização adrenérgica não modulou a resposta das células iNKT à αGC. Ademais, a hiperativação adrenérgica foi capaz de inibir o dano hepático sem alterar a atividade antitumoral das células iNKT. No entanto, foi observado que a sinalização adrenérgica inibiu o infiltrado de células mieloides no fígado após a administração de αGC. Portanto, nossos dados mostram que as células iNKT não são susceptíveis à sinalização adrenérgica como os linfócitos T convencionais e a inibição de célulasmieloides pode ser responsável pela proteção hepática. Assim, a modulação dos receptores adrenérgicos pode ser utilizada como alternativa para melhorar o prognóstico imunoterapia baseada em linfócitos iNKT, diminuindo os efeitos colaterais sem prejudicar a sua eficácia terapêutica.