Inibidores de peptidases das sementes de pau-brasil em modelo de inflamação pulmonar
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Data
2010-05-26
Autores
Cruz-Silva, Ilana [UNIFESP]
Orientadores
Araujo, Mariana da Silva [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (Cat G) are important peptidases involved in the defense against microorganisms and their activities are strictly controlled by endogenous inhibitors. However, in some diseases, as pulmonary edema, there is a misbalance between these enzymes and their inhibitors. It is already known that pulmonary edema treatment with NE inhibitors can diminish the severity of this disease, but little is known about Cat G inhibitors. As the available commercial inhibitors present many collateral effects or low efficiency, the search for new inhibitors is justified. Our laboratory has already purified, characterized, cloned and expressed peptidase inhibitors from Caesalpinia echinata (pau-brasil) seeds, as a human plasma kallikrein inhibitor (CeKI), which also inhibits Cat G and an EN and Cat G inhibitor (CeEI). It would be interesting to explore the action of these inhibitors for a better understand of each enzyme contribution on the pulmonary edema physiopathology. So the aim of this work was to express, purify and characterize a recombinant C. echinata elastase inhibitor (rCeEI), determinate the smallest active peptide, and also verify the effect of these inhibitors in an in vivo pulmonary edema model and the role of NE in a culture of alveolar epithelial type II cells. After cloning the cDNA (700 pb) fragment, two sequences with the same reactive site but some different amino acids residues (rCeEI-4 e rCeEI-5) were isolated and their specificities were tested. According the kinetics studies the NE inhibition by CeEI is a mix type, but they showed different dissociation constants for Cat G. In order to obtain the smallest active peptide, primers were designed and the DNA fragment was inserted into the plasmid for expression in bacteria (E. coli stain BL21Si) or yeast (Pichia pastoris). Although both proteins inhibited the same enzymes, they showed different affinities for Cat G and chymotrypsin. The smallest active peptide was obtained by the CeEI reactive site in their tertiary structure. Three possible active fragments were delimited; two of them were produced by Molecular Biology and one was synthesized. The smallest active peptide is the whole protein which is stable and maintains its activity. For in vivo studies, Wistar rats received Cat G inhibitor (CeKI), or Cat G and NE inhibitor rCeEI in their tail. In sequence, animals received 75 μg lipopolysaccharide in their tracheas, and after six hours they were killed, blood was collected, bronchoalveolar fluid was performed (BALF) and lungs were processed. In this in vivo model, some alterations have been observed in the animals treated with the two inhibitors: in the BALF, decreased the numbers of polymorphonuclear leukocyte cells, the angiotensin converting enzyme activity and the presence of kinin; in the blood, kinin releasing was diminished; in the lung, the Cat G activity was decreased, however, they were observed lower NE and myeloperoxidase activities only when animals were treated with NE and Cat G inhibitor (rCeEI). Also, only animals treated with rCeEI had and increasing in interleukin 6 concentrations. These results show that both inhibitors are able to diminish the pulmonary inflammatory process, although rCeEI was more effective. It was primary culture of epithelial alveolar cells type II from lungs of neonate Wistar rats and the identification of these cells was performed with antibody anti surfactant associated to protein C. NE can induce cells death by apoptosis, which could aggravate the lung injury.
Elastase de neutrófilos (EN) e catepsina G (Cat G), importantes peptidases na defesa contra mircoorganismos, têm suas atividades rigorosamente controladas por inibidores endógenos; entretanto, quando ocorre algum desequilíbrio entre essas enzimas e seus inibidores podem ocasionar algumas doenças, como o edema pulmonar. Sabe-se que o tratamento do edema pulmonar com inibidores de EN pode resultar em uma diminuição da severidade da doença; mas, pouco se conhece sobre os inibidores de Cat G nesse processo, além disso, os inibidores disponíveis no mercado, possuem efeitos colaterais graves ou baixa eficiência, tornando justificada a busca por novos inibidores. Nosso laboratório vem, há algum tempo, purificando e caracterizando, clonando e expressando inibidores de peptidases contidos em sementes de Caesalpinia echinata (pau-brasil), como um inibidor de calicreína plasmática que também inibi Cat G (CeKI) e outro de EN e Cat G (CeEI). Sendo assim, seria interessante explorar a ação desses inibidores na fisiopatologia do edema pulmonar, para uma melhor compreensão da participação de cada uma dessas enzimas na patologia. Para isso, os objetivos desse trabalho foram expressar, purificar e caracterizar o CeEI recombinante, determinar o menor peptídeo ativo do inibidor e testá-los em um modelo animal in vivo de edema pulmonar, além de verificar o papel da EN em uma cultura de células epiteliais alveolares do tipo II. Após a clonagem do fragmento de cDNA (700 pb), obtiveram-se duas seqüências, com o mesmo sítio reativo (rCeEI-4 e rCeEI-5) que foram avaliados quanto à sua especificidade na hidrólise de substratos sintéticos. Embora a ação de ambos inibidores sobre EN seja enzimaticamente classificada como parcial mista, eles apresentaram afinidades diferentes com relação à Cat G. Para a obtenção do menor peptídeo ativo, com base na sequencia primária e terciária do inibidor foram delimitados três possíveis fragmentos ativos, dois dos quais foram produzidos por Biologia Molecular e um sintetizado. Chegou-se à conclusão de que era necessária a seqüência completa do inibidor para sua melhor atividade e estabilidade. Para o modelo in vivo de edema pulmonar, soluções do CeKI, ou do rCeEI-4, em diferentes concentrações, foram injetadas na cauda de ratos Wistar. Em seguida, os animais receberam lipopolissacarídeo pela traquéia e, após seis horas, foram mortos, procedendo-se a sangria, lavagem broncoalveolar (BAL) e processamento do pulmão para análise. Nesse modelo in vivo, observou-se que os animais tratados com os dois inibidores apresentaram número de células polimorfonucleares diminuído no BAL. Tanto no BAL quanto no sangue, o tratamento com inibidores diminuiu a concentração de cininas e no pulmão, observou-se uma diminuição da atividade de Cat G, entretanto só houve diminuição das atividades do tipo EN e de mieloperoxidase, quando os animais foram tratados com rCeEI. Em relação às citocinas, foi observado que somente o rCeEI foi capaz de aumentar as concentrações de interleucina 6. Isso indica que apesar de ambos inibidores serem capazes de diminuir o processo inflamatório agudo do pulmão, rCeEI agiu de uma forma mais efetiva. Para a cultura de células pulmonares do tipo II, foram utilizados ratos Wistar recém-nascidos e a identificação das células foi feita com anticorpo anti-proteína C associada a surfactante pulmonar. EN parece induzir a morte celular, do tipo apoptose, nessas células, aumentando a gravidade da doença.
Elastase de neutrófilos (EN) e catepsina G (Cat G), importantes peptidases na defesa contra mircoorganismos, têm suas atividades rigorosamente controladas por inibidores endógenos; entretanto, quando ocorre algum desequilíbrio entre essas enzimas e seus inibidores podem ocasionar algumas doenças, como o edema pulmonar. Sabe-se que o tratamento do edema pulmonar com inibidores de EN pode resultar em uma diminuição da severidade da doença; mas, pouco se conhece sobre os inibidores de Cat G nesse processo, além disso, os inibidores disponíveis no mercado, possuem efeitos colaterais graves ou baixa eficiência, tornando justificada a busca por novos inibidores. Nosso laboratório vem, há algum tempo, purificando e caracterizando, clonando e expressando inibidores de peptidases contidos em sementes de Caesalpinia echinata (pau-brasil), como um inibidor de calicreína plasmática que também inibi Cat G (CeKI) e outro de EN e Cat G (CeEI). Sendo assim, seria interessante explorar a ação desses inibidores na fisiopatologia do edema pulmonar, para uma melhor compreensão da participação de cada uma dessas enzimas na patologia. Para isso, os objetivos desse trabalho foram expressar, purificar e caracterizar o CeEI recombinante, determinar o menor peptídeo ativo do inibidor e testá-los em um modelo animal in vivo de edema pulmonar, além de verificar o papel da EN em uma cultura de células epiteliais alveolares do tipo II. Após a clonagem do fragmento de cDNA (700 pb), obtiveram-se duas seqüências, com o mesmo sítio reativo (rCeEI-4 e rCeEI-5) que foram avaliados quanto à sua especificidade na hidrólise de substratos sintéticos. Embora a ação de ambos inibidores sobre EN seja enzimaticamente classificada como parcial mista, eles apresentaram afinidades diferentes com relação à Cat G. Para a obtenção do menor peptídeo ativo, com base na sequencia primária e terciária do inibidor foram delimitados três possíveis fragmentos ativos, dois dos quais foram produzidos por Biologia Molecular e um sintetizado. Chegou-se à conclusão de que era necessária a seqüência completa do inibidor para sua melhor atividade e estabilidade. Para o modelo in vivo de edema pulmonar, soluções do CeKI, ou do rCeEI-4, em diferentes concentrações, foram injetadas na cauda de ratos Wistar. Em seguida, os animais receberam lipopolissacarídeo pela traquéia e, após seis horas, foram mortos, procedendo-se a sangria, lavagem broncoalveolar (BAL) e processamento do pulmão para análise. Nesse modelo in vivo, observou-se que os animais tratados com os dois inibidores apresentaram número de células polimorfonucleares diminuído no BAL. Tanto no BAL quanto no sangue, o tratamento com inibidores diminuiu a concentração de cininas e no pulmão, observou-se uma diminuição da atividade de Cat G, entretanto só houve diminuição das atividades do tipo EN e de mieloperoxidase, quando os animais foram tratados com rCeEI. Em relação às citocinas, foi observado que somente o rCeEI foi capaz de aumentar as concentrações de interleucina 6. Isso indica que apesar de ambos inibidores serem capazes de diminuir o processo inflamatório agudo do pulmão, rCeEI agiu de uma forma mais efetiva. Para a cultura de células pulmonares do tipo II, foram utilizados ratos Wistar recém-nascidos e a identificação das células foi feita com anticorpo anti-proteína C associada a surfactante pulmonar. EN parece induzir a morte celular, do tipo apoptose, nessas células, aumentando a gravidade da doença.
Descrição
Citação
SILVA, Ilana Cruz. Inibidores de peptidases das sementes de pau-brasil em modelo de inflamação pulmonar. 2010. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2010.