Carcinoma Papilífero da Tiróide: Perfil de Expressão Gênica, Prevalência da Mutação V600E no Gene BRAF, Correlação com Fatores Clínico-Patológicos e Análise Funcional de uma Nova Mutação no Gene BRAF

Oler, Gisele [UNIFESP]

Carcinoma Papilífero da Tiróide: Perfil de Expressão Gênica, Prevalência da Mutação V600E no Gene BRAF, Correlação com Fatores Clínico-Patológicos e Análise Funcional de uma Nova Mutação no Gene BRAF

Data

2009-01-28

Autores

Oler, Gisele [UNIFESP]

Orientadores

Cerutti, Janete Maria [UNIFESP]

Tipo

Tese de doutorado

Resumo

A substituição de base 1799T>A, localizada no exon 15 do gene BRAF e que resulta na substituição de uma valina por um ácido glutâmico no códon 600 (V600E), vem sendo descrita como o evento genético mais freqüente e específico do carcinoma papilífero da tiróide (CPT). A prevalência desta mutação varia de 22.9 e 63% nas diferentes populações estudadas, com freqüência mundial de aproximadamente 50%. Embora ainda existam algumas discordâncias, diversos estudos têm demonstrado que mutação em BRAF é um evento genético importante tanto na patogênese do CPT como na determinação de um tumor com propriedades biológicas mais agressivas e pior prognóstico. Alguns trabalhos sugerem que o impacto da mutação no prognóstico do paciente com CPT esta associado à expressão reduzida de genes envolvidos no metabolismo do iodo, com conseqüente diminuição de resposta ao tratamento com I131. Inicialmente avaliamos, por meio de sequenciamento direto, a freqüência desta mutação em nossa população e correlacionamos com fatores clínico-patológicos. Além disto, por meio de PCR em tempo real, analisamos a expressão de genes envolvidos no metabolismo de iodo (NIS e TSHR). Encontramos uma alta freqüência da mutação nos casos de CPT, compatível com a freqüência mundial, sendo predominantemente encontrada na forma clássica do CPT em relação a variante folicular. Além disto, encontramos uma significante correlação entre a presença da mutação com parâmetros patológicos de pior prognóstico e com a redução de expressão de NIS e TSHR. Estes dados corroboram com a literatura e sugerem que a análise da mutação em nossa população poderia auxiliar no planejamento de um tratamento adequado dos pacientes. Embora raras, outras mutações em BRAF já foram descritas. Entre elas, nosso grupo em 2005 descreveu uma nova mutação gerada pela deleção de três nucleotídeos (TGA) entre os codons 600 e 601 resultando na substituição V600E associada à deleção de uma lisina na posição 601, denominada V600E+K601del. Esta mutação foi identificada em três de oito casos de metástases para linfonodos de CPT na forma clássica. Subseqüentemente, esta mutação foi descrita em variantes mais raras e agressivas do carcinoma papilífero. Com o intuito de analisar o papel desta mutação na função da proteína BRAF, células de tirócitos normais de rato (PCCL3) foram transfectadas com vetores de expressão contendo o cDNA que codifica para a proteína BRAF Selvagem (Wt) ou para as mutações V600E e V600E+K601del. A análise dos clones selecionados e testados quando à expressão das isoformas demonstrou que a expressão da nova mutação induz a ativação da via MAPK, confere às células PCCL3 aumento na capacidade de proliferação independente de TSH e diminuição na porcentagem de células em apoptose. Observamos que a expressão da mutação BRAV V600E+K601del levou a um aumento na capacidade de crescimento independente de ancoragem, invasividade, migração e induziu instabilidade genética, quando comparada à mutação V600E. Estes resultados sugerem que a nova mutação confere um comportamento agressivo às células PCCL3. Ainda, por meio de modelagem molecular de proteínas e técnicas computacionais de simulação das proteínas BRAF V600E e BRAF V600E+K601del, observamos que a deleção da lisina 601 não leva a grandes mudanças estruturais e não parece afetar as propriedades de ligação com a droga BAY43-9006, cujos efeitos foram caracterizados na mutação V600E. Isto sugere que a utilização deste tipo de inibidores seria efetiva. Posteriormente, descrevemos o caso de uma paciente com a mutação BRAF V600E no tumor primário e a V600E+K601del na metástase para linfonodos e que apresentava baixa resposta aos tratamentos convencionais. Por meio de PCR em tempo real analisamos a expressão de NIS e TSHR no tumor primário desta paciente. Verificamos ausência de expressão de NIS e perda de expressão de TSHR, o que poderia em parte explicar a baixa resposta ao tratamento desta paciente, uma vez que o tratamento convencional com radiodo I131 depende não só do estímulo adequado com o hormônio tireoestimulante (TSH), mas também da habilidade das células tumorais de captar o I131. Por meio da análise de bibliotecas SAGE geradas a partir de CPT, de carcinoma e adenoma folicular da tiróide e tecido normal adjacente, identificamos transcritos diferencialmente expressos em CPT. A validação por meio de PCR em tempo real, em uma casuística composta por 57 tumores de tiróide e 14 tecidos normais adjacentes, permitiu confirmar os dados de SAGE para três dos transcritos selecionados (CST6, CXCL14 e DHRS3). Além disso, analisamos uma possível correlação entre a expressão destes transcritos e a presença de metástase ao diagnóstico e com a presença mutação V600E no gene BRAF. Encontramos uma significante correlação entre a expressão de CST6 e CXCL14 e a presença de metástase e da mutação V600E, sugerindo não somente um possível papel destes genes na progressão do carcinoma papilífero, mas também que estes poderiam ser regulados pela via BRAF-MEK-ERK.

Citação

OLER, Gisele. Carcinoma Papilífero da Tiróide: Perfil de Expressão Gênica, Prevalência da Mutação V600E no Gene BRAF, Correlação com Fatores Clínico-Patológicos e Análise Funcional de uma Nova Mutação no Gene BRAF. 2009. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2009.