Reprodutibilidade de padrões morfológicos no teste de autoanticorpos contra antígenos celulares (FAN-HEp-2) em diferentes substratos
Data
2020-11-18
Autores
Silva, Monica De Jesus [UNIFESP]
Orientadores
Andrade, Luiz Eduardo Coelho [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The indirect immunofluorescence assay on HEp-2 cells (HEp-2 IFA) is the gold standard method for anti-cellular (AC) antibody screening. Cell culture and fixation methods influence in the distribution and preservation of autoantigens, therefore affect in antigen preservation and distribution, as well as the AC patterns (1,2). Objective: We aimed to evaluate the non-reproducibility phenomenon of HEp-2 IFA results in different HEp-2 slide brands from patients with Systemic Autoimmune Disease (SAD), patients with Non-Autoimmune (NAD), and samples from healthy individuals. Methods: Were evaluated 868 serum samples from 275 patients with SAD, 293 patients with NAD, and 300 samples from healthy blood donors (HBD).Samples were processed at 1:80 dilution according to standard procedure on four HEp-2 slide brands. The tests were interpreted by three experienced independent blinded observers. The agreement among slides was determined using proportional weights according to the number of concordant slides in each sample, yielding a weighted score (ranging from 1 to 100) in specific groups of samples. The qualitative variables were analyzed by the Chi-square test and concordance was analyzed using the Kappa test. All data were analyzed using SPSS20.0 software at a significance level of p <0.05. Results: 402 samples were non-reagent in all slide brands and, therefore, were considered devoid of autoantibodies and eliminated from further analysis. The global reactivity agreement score obtained forth e remaining 466 samples (238 SAD, 119 NAD, and 109 HBD) was considered regular (74, 5). The nuclear compartment showed the highest agreement score (83,6), followed by the metaphase plate (78,9), cytoplasm (77,4) and nucleolus (72,4).Among the clinical groups, the agreement score was higher in SAD (78,0) than in NAD (70,6) and HBD (71,3). Samples with low reactivity (+/4) had higher discordance rates than high intensity samples (++++/4). In the SAD group the discordance for nuclear reactivity was 12.5% for ++++/4 samples, as opposed to 95.6% for +/4 samples, and the same was observed with NAD and HBD samples. The most robust nuclear patterns (higher concordance rate) were, Centromeric (score 78,4), Multiple Nuclear Dots (score73,6), Coarse Speckled (score71,3), and Homogeneous (score 67,9). Among the cytoplasmic patterns, the Reticular Cytoplasmic was more robust (68, 6). Conclusion: The phenomenon of non-reproducibility in the HEp-2 IFA among different slide brands occurs with highest frequency with samples with low intensity.
O teste de imunofluorescência indireta em células HEp-2 (IFI-HEp-2) é considerado padrão ouro para pesquisa de autoanticorpos anticélula (AC). Contudo, condições de cultivo e fixação celular interferem diretamente na preservação e distribuição antigênica, podendo impactar o reconhecimento dos padrões de imunofluorescência (1,2). Objetivo: Avaliar o fenômeno da não reprodutibilidade de resultados no teste de IFI-HEp-2 em diferentes substratos (lâminas) comerciais, comparando pacientes com doenças autoimunes (DAI), doenças não-autoimunes (DNAI) e indivíduos hígidos. Materiais e Métodos: Foram testadas 868 amostras de soro de 275 pacientes DAI, 293 de pacientes com DNAI e 300 amostras de doadores de sangue (DS) diluídas a 1:80 e processadas em lâminas de IFI-HEp-2 de quatro fornecedores distintos, seguida das leituras realizadas por três observadores independentes, experientes que desconheciam as características clínicas das amostras. Analisamos separadamente a reatividade em cada compartimento celular e a reatividade global, definida como reatividade contra qualquer compartimento celular. O grau de concordância obtido entre as lâminas recebeu pesos proporcionais ao número de lâminas concordantes, estabelecendo-se um escore ponderado (variando de 1 a 100) para grupos específicos de amostras. As variáveis qualitativas foram analisadas pelo teste do Chi-quadrado e as análises de concordâncias pelo teste Kappa. Todos os dados foram analisados no software SPSS 20.0 em nível de significância de p<0,05. Resultados: 402 amostras foram negativas nas quatro lâminas e excluídas do estudo. O escore ponderado de concordância de reatividade global nas 466 amostras restantes (238 DAI, 119 DNAI e 109 DN) foi considerado regular (74,5). O compartimento nuclear apresentou a maior pontuação de concordância (83,6) seguida do compartimento placa metafásica (78,9), compartimento citoplasmático (77,4), e nucléolo (72,4). Entre os grupos clínicos, o grupo DAI (78,0) apresentou escore de concordância global superior aos grupos DNAI (70,6) e DS (71,3). Amostras com menor intensidade de imunofluorescência (+/4) apresentaram maiores taxas de discordância que amostras com alta intensidade (++++/4). Por exemplo, no grupo DAI a taxa de discordância no compartimento nuclear foi de 12,5% para amostras ++++/4 e de 95,6%para amostras +/4. O mesmo fenômeno foi observando nos grupos DNAI e DS. Os padrões morfológicos nucleares de maior robustez foram o Centromérico (escore 78,4), Múltiplos Pontos Isolados (73,6) Pontilhado Grosso, (71,3) e Homogêneo (67,9). Para os padrões citoplasmáticos, o Pontilhado Reticulado (68,6) foi o mais robusto. Conclusão: O fenômeno da não reprodutibilidade de resultados em distintas lâminas HEp-2 ocorre com alta frequência e predominantemente em amostras de baixa intensidade.
O teste de imunofluorescência indireta em células HEp-2 (IFI-HEp-2) é considerado padrão ouro para pesquisa de autoanticorpos anticélula (AC). Contudo, condições de cultivo e fixação celular interferem diretamente na preservação e distribuição antigênica, podendo impactar o reconhecimento dos padrões de imunofluorescência (1,2). Objetivo: Avaliar o fenômeno da não reprodutibilidade de resultados no teste de IFI-HEp-2 em diferentes substratos (lâminas) comerciais, comparando pacientes com doenças autoimunes (DAI), doenças não-autoimunes (DNAI) e indivíduos hígidos. Materiais e Métodos: Foram testadas 868 amostras de soro de 275 pacientes DAI, 293 de pacientes com DNAI e 300 amostras de doadores de sangue (DS) diluídas a 1:80 e processadas em lâminas de IFI-HEp-2 de quatro fornecedores distintos, seguida das leituras realizadas por três observadores independentes, experientes que desconheciam as características clínicas das amostras. Analisamos separadamente a reatividade em cada compartimento celular e a reatividade global, definida como reatividade contra qualquer compartimento celular. O grau de concordância obtido entre as lâminas recebeu pesos proporcionais ao número de lâminas concordantes, estabelecendo-se um escore ponderado (variando de 1 a 100) para grupos específicos de amostras. As variáveis qualitativas foram analisadas pelo teste do Chi-quadrado e as análises de concordâncias pelo teste Kappa. Todos os dados foram analisados no software SPSS 20.0 em nível de significância de p<0,05. Resultados: 402 amostras foram negativas nas quatro lâminas e excluídas do estudo. O escore ponderado de concordância de reatividade global nas 466 amostras restantes (238 DAI, 119 DNAI e 109 DN) foi considerado regular (74,5). O compartimento nuclear apresentou a maior pontuação de concordância (83,6) seguida do compartimento placa metafásica (78,9), compartimento citoplasmático (77,4), e nucléolo (72,4). Entre os grupos clínicos, o grupo DAI (78,0) apresentou escore de concordância global superior aos grupos DNAI (70,6) e DS (71,3). Amostras com menor intensidade de imunofluorescência (+/4) apresentaram maiores taxas de discordância que amostras com alta intensidade (++++/4). Por exemplo, no grupo DAI a taxa de discordância no compartimento nuclear foi de 12,5% para amostras ++++/4 e de 95,6%para amostras +/4. O mesmo fenômeno foi observando nos grupos DNAI e DS. Os padrões morfológicos nucleares de maior robustez foram o Centromérico (escore 78,4), Múltiplos Pontos Isolados (73,6) Pontilhado Grosso, (71,3) e Homogêneo (67,9). Para os padrões citoplasmáticos, o Pontilhado Reticulado (68,6) foi o mais robusto. Conclusão: O fenômeno da não reprodutibilidade de resultados em distintas lâminas HEp-2 ocorre com alta frequência e predominantemente em amostras de baixa intensidade.