Avaliação da combinação de ferramentas de expressão gênica condicional em Plasmodium falciparum para estudos de genômica funcional e screening de potenciais antimaláricos
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Data
2020-09-04
Autores
Santos, Caroline Lima Dos [UNIFESP]
Orientadores
Azevedo, Mauro Ferreira De [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Introduction: Despite the advances, malaria remains a major public health problem, leading to the death of thousands of people every year, mainly children under 5 years old. The study of essential genes for the parasite's life cycle is important for the development and validation of new antimalarials. Using reverse genetics, it has been possible to characterize important genes for the development of P. falciparum. It is common to use conditional gene expression to carry out these studies, but there’s still an expression leak that prevents a wider use. Methods for detecting the action of antimalarial drugs currently used take a long time to generate results, some of which are of low sensitivity and practicality, requiring the development of a fast method, of low cost and capable of being used on large scale. Objectives: To enhance conditional gene expression systems based on the combination of existing tools and to evaluate their application in assays for the detection of fast-acting antimalarials and in studies of essential genes. Methods: In order to evaluate the performance of conditional gene expression systems, plasmids were constructed with different combinations of these, being fused with Nluc-GFP, to assess regulation. Synchronized parasites in ring or trophozoite stages were grown in different combinations of the ligands used to regulate the systems and the results of gene expression determined by bioluminescence and fluorescence. For future functional analyzes of essential genes, strains were generated with some plasmids integrated in the genomic loci of interest. Results: The fusion of the conditional gene expression systems enhanced the induction capacity by up to 41x, with the 5D fusion being faster to induce in rings and the ribozyme glmS in trophozoites. Using the Nluc- 5D-glmS strain, which contains the 3 systems combined, as a method of detecting the action of antimalarials, it was possible to detect a 50% decay activity by the action of chloroquine in just 4 hours and to differentiate slow-acting antimalarials from fast-acting ones. In preliminary experiments, it was possible to observe a phenotypic effect in the parasites due to the modulation of the expression of the kinases CDPK1 and CDPK5 using some of the combinations of systems generated. Conclusion: Notably, when constructing a plasmid with different domains in fusion, its regulatory potential is multiplied and by using the parasites that express this construction it is possible to identify the action of drugs quickly, with high sensitivity and at low cost. You can also use them to conditionally knock out essential genes such as CDPK1 and CDPK5.
Introdução: Apesar dos avanços, a malária continua sendo um grande problema de saúde pública, levando a morte milhares de pessoas todos os anos, sendo a maioria de crianças de até 5 anos. O estudo de genes essenciais para o ciclo de vida do parasita é parte importante para o desenvolvimento e validação novos antimaláricos. Utilizando a genética reversa, tem sido possível caracterizar genes importantes para o desenvolvimento de P. falciparum. É comum usar a técnica de expressão gênica condicional para realização destes estudos, porém estes ainda apresentam um vazamento expressão que impede uma utilização mais ampla. Métodos de detecção de ação de antimaláricos atualmente utilizados levam muito tempo para gerar resultados, sendo alguns deles de baixa sensibilidade e praticidade, necessitando que seja desenvolvido um método rápido, de baixo custo e capaz de emprego em larga escala. Objetivos: Potencializar sistemas de expressão gênica condicional a partir da combinação de ferramentas já existentes e avaliar sua aplicação em ensaios para detecção de antimaláricos de ação rápida e nos estudos de genes essenciais. Métodos: A fim de avaliar a performance dos sistemas de expressão genica condicional, foram construídos plasmídeos com diferentes combinações destes, sendo eles em fusão com Nluc-GFP, para avaliar a regulação. Parasitas sincronizados nos estágios de anel ou trofozoíta foram cultivados em diferentes combinações dos ligantes utilizados para regular os sistemas e os resultados de expressão gênica determinados por por bioluminescência e fluorescência. Para futuras análises funcionais de genes essenciais, foram geradas linhagens com algums plasmídeos integrados nos loci genômicos de interesse. Resultados: As fusões dos sistemas de expressão gênica condicional potencializaram a capacidade de regulação em até 41x, sendo a fusão 5D mais rápida para regular em anel e a ribozima glmS para em trofozoíta. Utilizando a linhagem Nluc-5D-glmS, que contém os 3 sistemas combinados como método de detecção de ação de antimalários, foi possível detectar a queda de 50% da atividade pela ação de cloroquina em apenas 4 horas e diferenciar antilamáricos de ação lenta daqueles de ação rápida. Em experimentos preliminares, foi possível observar efeito fenotípico nos parasitas decorrente da modulação da expressão das quianses CDPK1 e CDPK5 utilizando algumas das combinações de sistemas geradas. Conclusão: Notavelmente, ao construir um plasmídeo com diferentes domínios em fusão, multiplica-se seu potencial de regulação e utilizando o parasita que expressa essa construção é possível identificar a ação de drogas de forma rápida, sensível e de baixo custo. Também é possível utilizá-los para nocautear de forma condicional genes essenciais como CDPK1 e CDPK5.
Introdução: Apesar dos avanços, a malária continua sendo um grande problema de saúde pública, levando a morte milhares de pessoas todos os anos, sendo a maioria de crianças de até 5 anos. O estudo de genes essenciais para o ciclo de vida do parasita é parte importante para o desenvolvimento e validação novos antimaláricos. Utilizando a genética reversa, tem sido possível caracterizar genes importantes para o desenvolvimento de P. falciparum. É comum usar a técnica de expressão gênica condicional para realização destes estudos, porém estes ainda apresentam um vazamento expressão que impede uma utilização mais ampla. Métodos de detecção de ação de antimaláricos atualmente utilizados levam muito tempo para gerar resultados, sendo alguns deles de baixa sensibilidade e praticidade, necessitando que seja desenvolvido um método rápido, de baixo custo e capaz de emprego em larga escala. Objetivos: Potencializar sistemas de expressão gênica condicional a partir da combinação de ferramentas já existentes e avaliar sua aplicação em ensaios para detecção de antimaláricos de ação rápida e nos estudos de genes essenciais. Métodos: A fim de avaliar a performance dos sistemas de expressão genica condicional, foram construídos plasmídeos com diferentes combinações destes, sendo eles em fusão com Nluc-GFP, para avaliar a regulação. Parasitas sincronizados nos estágios de anel ou trofozoíta foram cultivados em diferentes combinações dos ligantes utilizados para regular os sistemas e os resultados de expressão gênica determinados por por bioluminescência e fluorescência. Para futuras análises funcionais de genes essenciais, foram geradas linhagens com algums plasmídeos integrados nos loci genômicos de interesse. Resultados: As fusões dos sistemas de expressão gênica condicional potencializaram a capacidade de regulação em até 41x, sendo a fusão 5D mais rápida para regular em anel e a ribozima glmS para em trofozoíta. Utilizando a linhagem Nluc-5D-glmS, que contém os 3 sistemas combinados como método de detecção de ação de antimalários, foi possível detectar a queda de 50% da atividade pela ação de cloroquina em apenas 4 horas e diferenciar antilamáricos de ação lenta daqueles de ação rápida. Em experimentos preliminares, foi possível observar efeito fenotípico nos parasitas decorrente da modulação da expressão das quianses CDPK1 e CDPK5 utilizando algumas das combinações de sistemas geradas. Conclusão: Notavelmente, ao construir um plasmídeo com diferentes domínios em fusão, multiplica-se seu potencial de regulação e utilizando o parasita que expressa essa construção é possível identificar a ação de drogas de forma rápida, sensível e de baixo custo. Também é possível utilizá-los para nocautear de forma condicional genes essenciais como CDPK1 e CDPK5.