Caracterização Estrutural Da Proteína Csm2, Uma Proteína Do Sistema Crispr-Cas
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Data
2018-11-12
Autores
Enamorado, Gloria Alejandra Gallo [UNIFESP]
Orientadores
Mori, Marcelo Alves Da Silva [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
The clusters of regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and the Cas (CRISPR‐associated) proteins form an adaptive immune system in bacteria and archaea that evolved as an RNA‐guided interference mechanism to target and degrade foreign genetic elements. This system consists of an operon composed of regions of identical repeats, separated by variable spacers derived from invading nucleic acids. Together with the Cas proteins, this system forms an adaptive and heritable immune system. The main objective of this project was to clone, recombinantly express and purify the Csm2 protein from Thermotoga maritima MSB8, for biochemical and structural characterization. This protein is part of a marginally studied complex of Cas ribonucleoproteins (RNP) termed the Csm complex, which is involved in the targeting of exogenous DNA. The protein was recombinantly produced in Escherichia coli BL21(DE3) and purified by affinity and gel filtration chromatography. After concentration, the protein crystallized in space group P3121 with an unit cell with dimensions a=77 Å b=77 Å c=160 Å α=90° β=90° γ=120°. Csm2 was solved via cadmium single wavelength anomalous diffraction phasing at 2,4 Å resolution at a wavelength of 1,458 Å. The structure reveals that Csm2 is composed of a large 42 amino-acid long α-helix flanked by three shorter α-helices. The structure also shows that the protein is capable of forming dimers mainly via an extensive contact surface conferred by its long α-helix. This interaction is further stabilized by the N-terminal helix, which is inserted into the C-terminal helical portion of the adjacent subunit. The dimerization of Csm2 was additionally confirmed by size exclusion chromatography of the pure recombinant protein followed by mass spectrometry analysis of the eluted fractions. Because of its role in the Csm CRISPR RNP complex, the crystal structure of Csm2 is of great importance for clarifying the mechanism of action of the subtype IIIA CRISPR-Cas system, in the context of the different CRISPR-Cas systems.
O sistema CRISPR-Cas é constituído pelas sequências CRISPR (Clustered Regularly Intespaced Short Palindromic Repeats) junto com as proteínas Cas (CRISPR associated) e tem como função conferir às bactérias e archaeas proteção contra DNA e RNA exógenos através de um mecanismo baseado em RNA de interferência (RNAi). Este sistema consiste em um óperon composto por repetições (repeats) de sequências idênticas entre si, separadas de sequências variáveis (spacers) provenientes dos ácidos nucleicos invasores, junto com proteínas Cas. O objetivo principal deste projeto foi clonar, expressar e purificar de forma recombinante a proteína Csm2 de Thermotoga maritima MSB8, relacionada ao sistema CRISPR-Cas, visando sua caracterização bioquímica e estrutural. A proteína Csm2 integra um complexo de ribonucleoproteínas (RNP) Cas menos estudadas, denominado complexo Csm, que está envolvido no processamento de DNA e RNA exógeno. A proteína foi produzida de forma recombinante em Escherichia coli BL21(DE3) e purificada por cromatografia de afinidade e filtração em gel. Após concentração, a proteína cristalizou no grupo espacial P3121 numa célula unitária com as dimensões a=77 Å b=77 Å c=160 Å α=90° β=90° γ=120°. A estrutura de Csm2 foi solucionada via difração anômala simples de cádmio a uma resolução de 2,4 Å e comprimento de onda de 1,458 Å. A estrutura revela que a Csm2 está composta de uma α-hélice longa de 42 aminoácidos rodeada de três α-hélices menores. Esta estrutura mostra que a proteína é capaz de formar dímeros devido a sua extensa superfície de contato atribuída por sua longa α-hélice. Esta interação é adicionalmente estabilizada pela hélice N-terminal, que é inserida dentro da porção helicoidal C-terminal da subunidade adjacente. A dimerização de Csm2 foi auxiliarmente confirmada por cromatografia de exclusão molecular da proteína pura recombinante, seguido de análises por espectrometria de massas das frações eluídas. Devido a seu papel no complexo ribonucleoproteíco CRISPR do tipo Csm, a estrutura da proteína Csm2 é importante para o entendimento do mecanismo de ação do sistema CRISPR-Cas subtipo III-A dentro do contexto dos diferentes sistemas CRISPR-Cas.
O sistema CRISPR-Cas é constituído pelas sequências CRISPR (Clustered Regularly Intespaced Short Palindromic Repeats) junto com as proteínas Cas (CRISPR associated) e tem como função conferir às bactérias e archaeas proteção contra DNA e RNA exógenos através de um mecanismo baseado em RNA de interferência (RNAi). Este sistema consiste em um óperon composto por repetições (repeats) de sequências idênticas entre si, separadas de sequências variáveis (spacers) provenientes dos ácidos nucleicos invasores, junto com proteínas Cas. O objetivo principal deste projeto foi clonar, expressar e purificar de forma recombinante a proteína Csm2 de Thermotoga maritima MSB8, relacionada ao sistema CRISPR-Cas, visando sua caracterização bioquímica e estrutural. A proteína Csm2 integra um complexo de ribonucleoproteínas (RNP) Cas menos estudadas, denominado complexo Csm, que está envolvido no processamento de DNA e RNA exógeno. A proteína foi produzida de forma recombinante em Escherichia coli BL21(DE3) e purificada por cromatografia de afinidade e filtração em gel. Após concentração, a proteína cristalizou no grupo espacial P3121 numa célula unitária com as dimensões a=77 Å b=77 Å c=160 Å α=90° β=90° γ=120°. A estrutura de Csm2 foi solucionada via difração anômala simples de cádmio a uma resolução de 2,4 Å e comprimento de onda de 1,458 Å. A estrutura revela que a Csm2 está composta de uma α-hélice longa de 42 aminoácidos rodeada de três α-hélices menores. Esta estrutura mostra que a proteína é capaz de formar dímeros devido a sua extensa superfície de contato atribuída por sua longa α-hélice. Esta interação é adicionalmente estabilizada pela hélice N-terminal, que é inserida dentro da porção helicoidal C-terminal da subunidade adjacente. A dimerização de Csm2 foi auxiliarmente confirmada por cromatografia de exclusão molecular da proteína pura recombinante, seguido de análises por espectrometria de massas das frações eluídas. Devido a seu papel no complexo ribonucleoproteíco CRISPR do tipo Csm, a estrutura da proteína Csm2 é importante para o entendimento do mecanismo de ação do sistema CRISPR-Cas subtipo III-A dentro do contexto dos diferentes sistemas CRISPR-Cas.