Pesquisa de biomarcadores proteicos para o sucesso da fertilização in vitro clássica através da análise proteômica do meio de cultura
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Date
2016-06-12
Authors
Moreira, Debora Carvalho [UNIFESP]
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Spaine, Deborah Montagnini Spaine [UNIFESP]
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Tese de doutorado
Journal Title
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Volume Title
Abstract
Introduction: Infertility is an important issue that affects many couples around the world and assisted reproduction technique more used in the treatment of these couples is the In Vitro Fertilization (IVF). The main challenge of IVF is to select an embryo with high potential implantation successful without generating unwanted multiple pregnancy. However, this selection is made subjectively by morphological analysis. New non-invasive methods are necessary for selection of embryos with higher implantation potential. Objectives: Evaluate the profile of secreted proteins during sperm-oocyte interaction in the conventional IVF process. Methods: We conducted a prospective cohort study including a total of 20 cases of couples that came to the Human Reproduction Division of UNIFESP and were suitable for conventional IVF. The patients underwent controlled ovarian stimulation as medical guidelines, followed by collection of ovarian follicles by transvaginal puncturing. Oocytes were placed in contact with spermatozoa previously selected in culture media for 18 hours.The remaining culture medium were pooledin the following groups according to the results of fertilization of oocytes and embryo development: normal fertilization (FN): presence of two pronuclei; fertilization failure (FF): absence of pronuclei; abnormal fertilization (FA): absence of pronuclei at the time of check fertilization, but there were embryonic development. The FN group was split into homogeneous development (F1) and heterogeneous (F3 and F4). The excess of albumin was removed from the sample, followed by fractionation and concentration using filter. The proteins were quantified, digested and analyzed by tandem mass spectrometry. Results: 73 proteins were identified. It was possible to identify proteins associated with successful fertilization and development. The main proteins marker were Perlecan (HSPG2) Anti-Thrombin-III (ANT 3), Apolipoprotein A-IV (APO4), Fibrinogenalpha Chain and Protein 4 Retinol-Binding (RET4) that were increased in the culture media and associated with success of IVF and homogeneous development. Conclusion: The embryos with fertilization success secreted a different protein profile from the cases of failure, and it was possible, from these proteins, to infer about embryo developmental outcome. These proteins may be potentially used in IVF success biomarkers in non-invasive testing of embryonic viability.
Introdução: A infertilidade é uma questão que afeta vários casais em todo mundo e a técnica de reprodução assistida mais utilizada no tratamento desses casais é a Fertilização in vitro (FIV). O principal desafio da FIV é selecionar um embrião com alto potencial de sucesso de implantação sem a geração de gravidez múltipla indesejada. Porém, essa seleção é realizada de maneira subjetiva através de análise morfológica. Novos métodos não invasivos são necessários para seleção de embriões com maior potencial de implantação. Objetivo: Avaliar o perfil de proteínas secretadas durante a interação espermatozoide-oócito no processo da FIV clássica. Metodologia: Foi realizado um estudo de coorte prospectivo incluindo um total de 20 casos, de casais que procuraram o Setor de Reprodução Humana da UNIFESP e que tiveram indicação de FIV clássica. As pacientes foram submetidas a estímulo ovariano controlado conforme orientações médicas, seguido de coleta dos folículos ovarianos por punção transvaginal. Os oócitos foram colocados em contato com espermatozoides previamente selecionados em meio de cultura por 18 horas. O meio de cultura remanescente foi agrupado de acordo com os resultados de fertilização dos oócitos e desenvolvimento embrionário nos seguintes grupos: Fertilização normal (FN): presença de dois pronúcleos; Falha de fertilização (FF): ausência de pronúcleos; Fertilização anormal (FA): ausência de pronúcleos no momento da checagem de fertilização, mas houve o desenvolvimento embrionário. O grupo FN foi divido em desenvolvimento homogêneo (F1) e heterogêneo (F3 e F4). Foi retirado o excesso de albumina da amostra, seguido de fracionamento e concentração por filtros. As proteínas foram quantificadas, digeridas e analisadas por espectrometria de massas em tandem. Resultados: Foram identificadas 73 proteínas. Foi possível identificar proteínas associadas ao sucesso de fertilização e de desenvolvimento. As principais proteínas marcadoras foram Perlecan (HSPG2), Anti-trombina-III (ANT 3), Apolipoproteína A-IV (APO4), Cadeia Alfa do Fibrinogênio e Proteína 4 ligante de Retinol (RET4) que estavam aumentadas em meio de cultura e estão associadas ao sucesso de FIV e desenvolvimento homogêneo. Conclusão: Os embriões com sucesso de fertilização secretam um perfil de proteínas diferentes dos casos de insucesso e ainda é possível, a partir dessas proteínas, inferir sobre o desfecho de desenvolvimento do embrião. Essas proteínas podem ser potencialmente utilizadas como marcadores de sucesso de FIV em testes não invasivos de viabilidade embrionária.
Introdução: A infertilidade é uma questão que afeta vários casais em todo mundo e a técnica de reprodução assistida mais utilizada no tratamento desses casais é a Fertilização in vitro (FIV). O principal desafio da FIV é selecionar um embrião com alto potencial de sucesso de implantação sem a geração de gravidez múltipla indesejada. Porém, essa seleção é realizada de maneira subjetiva através de análise morfológica. Novos métodos não invasivos são necessários para seleção de embriões com maior potencial de implantação. Objetivo: Avaliar o perfil de proteínas secretadas durante a interação espermatozoide-oócito no processo da FIV clássica. Metodologia: Foi realizado um estudo de coorte prospectivo incluindo um total de 20 casos, de casais que procuraram o Setor de Reprodução Humana da UNIFESP e que tiveram indicação de FIV clássica. As pacientes foram submetidas a estímulo ovariano controlado conforme orientações médicas, seguido de coleta dos folículos ovarianos por punção transvaginal. Os oócitos foram colocados em contato com espermatozoides previamente selecionados em meio de cultura por 18 horas. O meio de cultura remanescente foi agrupado de acordo com os resultados de fertilização dos oócitos e desenvolvimento embrionário nos seguintes grupos: Fertilização normal (FN): presença de dois pronúcleos; Falha de fertilização (FF): ausência de pronúcleos; Fertilização anormal (FA): ausência de pronúcleos no momento da checagem de fertilização, mas houve o desenvolvimento embrionário. O grupo FN foi divido em desenvolvimento homogêneo (F1) e heterogêneo (F3 e F4). Foi retirado o excesso de albumina da amostra, seguido de fracionamento e concentração por filtros. As proteínas foram quantificadas, digeridas e analisadas por espectrometria de massas em tandem. Resultados: Foram identificadas 73 proteínas. Foi possível identificar proteínas associadas ao sucesso de fertilização e de desenvolvimento. As principais proteínas marcadoras foram Perlecan (HSPG2), Anti-trombina-III (ANT 3), Apolipoproteína A-IV (APO4), Cadeia Alfa do Fibrinogênio e Proteína 4 ligante de Retinol (RET4) que estavam aumentadas em meio de cultura e estão associadas ao sucesso de FIV e desenvolvimento homogêneo. Conclusão: Os embriões com sucesso de fertilização secretam um perfil de proteínas diferentes dos casos de insucesso e ainda é possível, a partir dessas proteínas, inferir sobre o desfecho de desenvolvimento do embrião. Essas proteínas podem ser potencialmente utilizadas como marcadores de sucesso de FIV em testes não invasivos de viabilidade embrionária.
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Citation
MOREIRA, Debora Carvalho. Pesquisa de biomarcadores proteicos para o sucesso da fertilização in vitro clássica através da análise proteômica do meio de cultura. 2016. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.