Papel do colesterol e fitoesterol no processo de solubilização de membranas modelo por detergentes
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Data
2013-01-30
Autores
Franca, Ana David Cruz de [UNIFESP]
Orientadores
Riske, Karin Do Amaral Riske [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Detergentes anfifílicos são largamente utilizados como agentes solubilizadores de membranas biológicas. Entretanto, vários tipos de membrana apresentam fragmentos insolúveis, chamados de DRMs (membranas resistentes a detergentes), ricos em lipídios saturados, colesterol e certas proteínas. Esses DRMs guardam semelhança de composição com os rafts de membrana, que são microdomínios mais organizados. Portanto, existe uma tendência de associar DRMs a rafts e a membranas na fase líquido-ordenada (compostas de lipídios saturados e colesterol). O mecanismo de solubilização de membranas biológicas tem sido muito estudado com membranas modelo (bicamadas lipídicas formando vesículas), e é em geral descrito em três estágios à medida que a razão molar Rb = detergente ligado/lipídio aumenta: i) inicialmente, as moléculas de detergente são incorporadas nas bicamadas sem causar seu sompimento; ii) quando um limite de saturação é atingido (Rb,sat) o processo de solubilização tem início e bicamadas ricas em detergentes coexistem com micelas mistas; iii) ao final (acima de Rb,sol), não restam mais bicamadas e todos os lipídios são incorporados em estruturas micelares. Neste trabalho, o processo de solubilização de membranas modelo foi estudado com bicamadas lipídicas de diferentes composições à temperatura ambiente e em diferentes fases, formando vesículas unilamelares grandes (LUVs) e gigantes (GUVs). O detergente empregado foi o Triton X-100 (TX-100), amplamente utilizado como agente solubilizador de membranas biológicas. As composições lipídicas e fases estudadas foram: POPC (palmitoil oleoil fosfatidilcolina, um lipídio insaturado) na fase fluida; SM (esfingomielina, um lipídio saturado) na fase gel; POPC/esterol 7:3 mol:mol na fase fluida; e SM/esterol 7:3 mol:mol na fase líquido-ordenada. Dois esterois distintos foram utilizados: o colesterol, o esterol mais abundante em membranas de animais, e o estigmasterol, um fitoesterol encontrado em membranas de células vegetais. Três técnicas foram empregadas. A microscopia óptica de GUVs foi utilizada para observar o processo de solubiliazação de GUVs em presença de TX-100. O espalhamento de luz a 90º de uma dispersão de LUVs à medida que alíquotas de uma suspensão de TX-100 eram adicionadas permitiu o monitoramento do processo de solubilização, que leva a uma redução drástica no tamanho das estruturas formadas. A calorimetria de titulação isotérmica (ITC), que mede o calor de reação de LUVs à medida que são tituladas com TX-100, foi empregada para obter aspectos termodinâmicos do processo de solubilização de LUVs de diferentes composições. Os resultados obtidos mostraram que o processo de solubilização depende fortemente da composição lipídica empregada. Vesículas na fase líquido-ordenada (SM/esterol) mostraram-se praticamente insolúveis, enquanto que vesículas nas fases fluida (POPC) e gel (SM) foram completamente solubilizadas. Vesículas de POPC/esterol foram apenas parcialmente solubilizadas. Durante o estágio I, de incorporação de TX-100 nas vesículas, foi observado por microscopia óptica um aumento de área superficial de GUVs de POPC, um enrugamento na superfície de GUVs de SM e um aumento de curvatura espontânea de GUVs de POPC/esterol. Estas mudanças morfológicas indicam que a taxa de flip-flop do TX-100 é modulada pela composição e fase da membrana. A taxa de flip-flop em membranas de POPC é extremamente rápida, não parece se alterar substancialmente em GUVs de SM, mas torna-se bem mais lenta com a adição de esterol. Medidas de espalhamento de luz e ITC mostraram que o limite de saturação de bicamadas de POPC foi atingido em Rb,sat = 0,4. Este valor diminuiu um pouco em bicamadas de SM, mas caiu à metade em membranas de POPC/esterol, o que poderia ser explicado pelas diferentes taxas de flip-flop. O limite de solubilização de bicamadas de POPC ocorreu em Rb,sol ~ 2,3. A solubilização completa de bicamadas de SM, na fase gel, foi atingida em razões bem menores: ~ 0,6, mostrando que bicamadas na fase gel são mais solúveis que na fase fluida. Medidas de ITC indicaram que o processo de solubilização de vesículas de SM é acompanhado da fluidificação das moléculas de SM. A solubilização de POPC/esterol não foi completa, e por espalhamento de luz atingiu um valor mínimo em Rb,sol = 0,8 (POPC/colesterol) e 1,4 (POPC/estigmasterol). Dos resultados obtidos pode-se concluir que a resistência à solubilização só ocorre na fase líquid-ordenada (SM/esterol). Entretanto, a composição POPC/esterol mostrou-se parcialmente insolúvel, devido provavelmente a uma baixa miscibilidade TX-100/colesterol.
Descrição
Citação
FRANCA, Ana David Cruz de. Papel do colesterol e fitoesterol no processo de solubilização de membranas modelo por detergentes. 2013. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2013.