A atividade da BS desaminase não é responsável pela morte dos queratinóides que expressam o gene bsrm(gene de resistência a BS modificado)
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Data
2005
Autores
Machado, Tamara da Rocha [UNIFESP]
Orientadores
Han, Sang Won [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
A epressão do gene bsr leva à síntese da blasticidina S desaminase, que catalisa a reação de desaminação do antibiótico blasticidina S (BS) inativando-o. Como a atividade da enzima é específica para a BS e não para seus análogos, como a citosina ou citidina, o sistema bsr e BS tem sido usado amplamente para experimentos de transformação celular. Com o objetivo de acelerar o processo de seleção, que é uma etapa determinante para a transferência gênica ex vivo, o gene bsr foi modificado nas regiões não codificantes para aumentar a sua expressão gênica, e essa nova versão foi denominada de bsrm. A eficácia do sistema bsrm/BS foi testada em diversos tipos celulares satisfatoriamente, exceto para os queratinócitos. Quando o bsrm foi introduzido nos queratinócitos via vetor retroviral, estas células entraram em apoptose em poucos dias. Parece que a expressão do gene bsrm instabiliza os queratinócitos e provoca estresse celular. A conseqüência disso é a geração de uma série de produtos de estresse oxidativo, tais como o peróxido de hidrogênio e o malonaldialdeído, que são extremamente tóxicos. Para entender o mecanismo molecular e genético de morte celular iniciada com a expressão do gene bsrm, a primeira pergunta que surge é se existe algum substrato da BS desaminase nos queratinócitos. Como a procura deste substrato é uma tarefa muito difícil, a pergunta foi refeita da seguinte forma: a atividade enzimática de BS desaminase é responsável pelo início do processo da morte dos queratinócitos? Esta pergunta tem o apoio de alguns resultados anteriores com o gene bsd, que foi isolado do fungo A. terreus e tem apenas 27,2 por cento de homologia em relação ao bsr. O bsd expressa a BS desaminase com a atividade enzimática bem superior à expressa pelo bsr, mas não tem efeito tóxico nos queratinócitos. Para responder a pergunta do trabalho, inicialmente os sítios responsáveis pela atividade enzimática foram identificados e seus mutantes foram gerados: E61 A, E61 D, C59A, C100A e C103A. Os vetores retrovirais dos mutantes de bsrm foram gerados para comparar com o vetar retroviral LBmSN, que tem a mesma estrutura de vetar que s mutantes, mas carrega o gene bsrm selvagem. Inicialmente, as células produtoras de vírus PA317 mutantes do bsrm e as células alvo, NIH3T3 mutantes do bsrm, foram testadas quanto à capacidade de resistência contra a BS. Todas as células que expressam os mutantes não...(au).
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Citação
São Paulo: [s.n.], 2005. 83 p.