Expressao e caracterizacao de uma potencial neurotoxina de veneno da serpente Micrucus corallinus(cobra coral)
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Data
2001
Autores
Silva, Solange Maria da [UNIFESP]
Orientadores
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Varios cDNAs codificando potenciais toxinas, isolados da glandula de M corallinus (cobra coral), foram descritos por HO et al., 1995. Um deste cDNAs, o clone VI, codificando para uma potencial neurotoxina foi utilizado neste estudo, para expressao no sistema P. pastoris, uma levedura metilotrofica. O cDNA foi amplificado por tecnica de PCR, onde oligonucleotideos apropriados foram usados para remover o peptideo sinal e introduzir sitios de restricao compativel com o vetor de expressao. O produto do PCR foi subclonado no vetor pPlC-9 e a construcao foi confirmada por analise de restricao e sequenciamento do 5'final. A construcao pPlC-9+V1 foi linearizado e usada para transformar celulas competente P pastoris. Transformantes His+Mut- foram selecionadas e sua capacidade de secretar toxina recombinante para o meio de cultura foram analisadas por SDS-PAGE. Uma banda muito fraca correspondente a massa molecular esperada (6.5kDa) foi detectada em algumas culturas. Uma dessas foi revelada com o soro contra o veneno total da coral (I. Butantan). Uma larga escala de cultura foi preparada e usada e purificada por FPLC utilizando uma coluna de gel filtracao (Superose 12). Dois dos muitos picos foram selecionados para estudos funcionais em sistema Campo Aberto. As fracoes foram injetada (i.p.) em camundongos, observando assim uma reducao locomotora, a qual sugere que este polipepitideo provavelmente participe no sistema nervoso central. A analise por espectrometria de massa demonstrou que este componente sao proteolizados na forma de toxina madura. Dificuldades significantes foram encontradas para analisar a proteina recombinante, devido ao alto conteudo de A+T encontrada na sequencia que codifica a neurotoxina, expressando num baixo nivel de expressao. Na tentativa de superar este problema, nos tentamos melhor a efiCiência da expressao da proteina, atraves de um gene sintetico, o qual foi designado de acordo com os codons preferenciais da P pastoris, com a ajuda do programa RNAdraw. Dez oligos foram sintetizado, um anelamento por PCR foi feito e em seguida ligados. O produto de PCR foi usado como template para outro PCR. O produto deste segundo PCR foi clonado em PGEM-T e transformado em DH5a. A construcao foi por sequenciamento de DNA. Em seguida clonado em pRSET-C (bacteria) e pPlC-9K(levedura) e induzidos para expressao da toxina
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2001. 94 p. ilustab.